背景青蒿是一年生菊科植物黄花蒿(AretemisiaannuaL.)的干燥地上部分。70年代,我国科研人员首次从黄花蒿叶中提取分离有过氧基团的倍半萜内酯药物,命名为青蒿素(Artemisinin, ART)。青蒿素主要衍生物包括双氢青蒿素(Aihydroartemisinin, DHA)、蒿甲醚(Artemether, AM)、蒿乙醚(Arteether, AE)、青蒿琥酯(Artesunate, AS)。青蒿素及其衍生物具有高效、低毒、不易产生耐药性的特点,被世界卫生组织推荐为高效安全的重要抗疟药。近年来研究发现,青蒿素及其衍生物除了显著的抗疟疗效外,还具有很强的抗炎、抗肿瘤、抗真菌、抗血管生成等作用。其中,其抗血管新生作用越来越受到人们重视,但具体作用机制尚不明确。动脉粥样硬化性心血管疾病(Arteriosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)是造成人类死亡率最高的疾病之一。大约有75%急性冠脉事件和60%有症状的颈动脉疾病和动脉粥样硬化斑块破裂有关。动脉粥样硬化斑块内血管新生是决定斑块生长、易损、破裂的重要因素。在缺氧、缺血、炎症等条件下,细胞分泌VEGF和碱性成纤维细胞生长因子等激活临近的内皮细胞,原有血管管腔扩张,通透性增加,分泌金属蛋白酶等降解基底细胞膜和细胞外基质,刺激内皮细胞迁移和增殖。内皮细胞分泌胶原蛋白,内皮细胞重构,新生血管形成。斑块内血管新生与斑块发展程度、斑块的易损性密切相关。新生血管常位于斑块内炎性细胞、巨噬细胞浸润区和动脉粥样硬化斑块薄纤维帽的肩部,易发生破裂、血管栓塞。形态异常和出血是易损斑块新生血管的主要特征。新生血管,管壁脆弱,容易破裂、渗漏。大量红细胞外渗不仅直接引起坏死核心扩大、管腔闭塞,而且红细胞膜富含胆固醇,脂质氧化产物促进炎症细胞聚集,巨噬细胞、T淋巴细胞活化,释放VEGF和金属蛋白酶,促进粥样斑块内新生血管形成和继发斑块内出血,导致恶性循环。动脉粥样硬化性心血管疾病是一种慢性炎性疾病,在斑块的发展中许多促血管生成途径都被重新激活,形成不成熟的新生血管,导致斑块破裂出血,血栓形成,急性事件发生。因此,抑制斑块内血管新生对防治动脉粥样硬化心血管疾病具有重要意义。目前抗血管新生药物按照作用靶点的不同主要分为酪氨酸激酶抑制剂,核酸抑制剂,VEGF抑制剂,基质金属蛋白酶抑制剂,新生血管内皮细胞抑制剂,非特异性血管生成抑制剂和天然中草药物。酪氨酸激酶抑制剂研究较为成熟,占主要的优势。然而多数酪氨酸激酶抑制剂对多种酪氨酸激酶靶点均有抑制作用,在抗肿瘤活性的同时产生高血压,蛋白尿,伤口愈合不良等多种不良反应。发展选择性高、耐受性好、副作用少的的新生血管抑制剂成为研究趋势。内皮细胞迁移是血管新生的重要组成部分。内皮细胞在趋化、趋触、机械等刺激作用产生的定向移动,形成迁移。VEGF是目前最强的血管生长因子,在内皮细胞迁移中发挥重要作用。与其受体结合后,引起受体自身磷酸化,诱导内皮细胞增生、迁移。同时VEGF诱导血管内皮细胞产生纤溶酶原激活剂,降解细胞外基质蛋白,增加血管通透性,为血管新生提供条件。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路构成一个大的级联网络调节包括细胞迁移的多种生理过程。p38MAPK通路是MAPK重要的亚族之一,其将VEGF信号传达至微丝,诱导肌动蛋白细胞骨架重排调节细胞迁移。通过对细胞迁移的调节,p38MAPK在血管新生发挥重要调节作用。双氢青蒿素是青蒿素C10羟基还原半合成青蒿素衍生物。与其他药物相比,双氢青蒿素是一种有效的,水溶性的,具有较少副作用的抗疟药,具有较强的抗血管新生作用。目前关于信号传导通路对双氢青蒿素作用内皮细胞迁移的影响国内外尚未见报道。目的我们假设双氢青蒿素通过p38 MAPK通路抑制VEGF诱导的内皮细胞迁移。探讨p38MAPK信号通路在双氢青蒿素作用内皮细胞迁移的作用,为双氢青蒿素抑制动脉粥样硬化易损斑块血管新生提供理论指导。研究方法1. Transwell小室细胞迁移实验：取对数生长期的人脐静脉内皮细胞消化后离心,成1×105单细胞悬液,接种到24孔Transwell上层小室中。分为DHA加药组、DHA+SB203850加药组和空白对照组,在DHA和SB203850组分别加入20uM DHA和20uM SB 203850,在下层小室中加入500μl含10%胎牛血清的完全培养基与20ng/ml VEGF。在倒置显微镜下计数迁移细胞数。2.划痕愈合实验：将长势良好的人脐静脉内皮细胞接种在在24孔板中,加入100ng/ml VEGF,待细胞数长至70%左右,24孔板底部形成致密单层细胞层时,用无菌吸管尖端作划痕。DHA组加入20μM DHA, SB 203850组加入20uM SB 203850; DHA+SB203850组加入20uM DHA,20uM SB 203850;放入细胞培养箱中继续培养,0h,6h,12h,24h观察细胞数量及形态及生长趋势变化。3. Western Blot分析对数期生长的人脐静脉细胞胰酶消化后调整浓度为2.5 X 105个/孔接种至六孔板,加入浓度为100ng/ml的VEGF。分为八组,待细胞增殖达70-80%时,茴香素组加入p38 MAPK激动剂茴香素。0.5h、1h、2h、6h、12h、24h DHA组加入20uM DHA,提取蛋白。Western Blot分析p38 MAPK信号通路蛋白总p38、磷酸化p38蛋白水平变化。4.细胞电子阻抗传感系统分析人脐静脉内皮细胞接种于8孔ECIS电极板上,分为DHA组,SB203850+DHA组,SB203850组和空白对照组。脐静脉内皮细胞直接在电极上面生长形成单层细胞层。分别给予40 kHz的高电压脉冲30秒电击,导致部分细胞损伤、死亡从电极脱落。在DHA组加入20uM DHA, SB203850+DHA组加入20uM DHA, 20uM SB 203850, SB203850组加入20uM SB 203850,监控内皮细胞愈合修复过程,记录Oh、2h、4h、6h、8h、10h、12h电阻的变化。5.统计学方法所有实验数据用均数±标准差(mean±D)表示,数据经SPSS17.0软件处理分析。组间比较采用配对t检验,所有试验均至少重复3次,检验的显著性水平定义为a=0.05,P<0.05为存在显著性差异。结果1.双氢青蒿素抑制内皮细胞迁移Transwell小室迁移实验表明DHA组与对照组相比,内皮细胞迁移数量明显减少(33.76%,P<0.01)。8h后观察细胞划痕实验结果表明DHA组内皮细胞的迁移入划痕区域明显减少(40.97%,p<0.01)。细胞电子阻抗传感系统(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing, ECIS)伤痕愈合实验中2h后DHA组内皮细胞阻抗较对照组明显减少。随着时间延长,阻抗差值逐渐增大。4h,8h,12h DHA组与对照组比较,DHA组阻抗值明显减低(4h p<0.05、8hp<0.05,12hp<0.01)。2. Western-blot检测p38 MAPK信号通路蛋白的表达没有显著变化与对照组相比,茴香霉素组磷酸化p38MAPK蛋白水平显著增高(P<0.05),DHA组0.5h,1h,2h,6h,12h,24h磷酸化p38MAPK蛋白水平没有统计学差异(P>0.05)。茴香霉素组、对照组、0.5h, 1h,2h,6h,12h,24hDHA组总p38 MAPK蛋白水平没有显著差异(P>0.05)。3.p38MAPK通路抑制剂SB 203850对双氢青蒿素抑制内皮细胞迁移没有影响Transwell、孔迁移实验显示SB 203850组与DHA+SB 203850组比较,DHA+SB 203850组内皮细胞迁移数量明显减少(P<0.01)；DHA+SB 203850组与DHA组比较,DHA+SB 203850组内皮细胞数目减少,但无统计学差异(P>0.05)。划痕实验中SB 203850组与DHA+SB 203850组比较,DHA+SB 203850组明显内皮细胞迁移划痕区域面积明显减少(P<0.05)；DHA+SB 203850组与DHA组比较,DHA6+SB 203850组减少的划痕面积略高,但没有统计学差异。ECIS伤痕愈合实验显示DHA对内皮细胞迁移抑制的时效关系。与空白对照组相比,DHA组、SB203850组、DHA+SB203850组在2h阻抗值开始降低。随着时间的延长,DHA组、SB203850组、DHA+SB203850组阻抗值逐渐降低,12h时阻抗差异最明显。DHA+SB203850组阻抗值<SB203850组阻抗值<DHA组阻抗值<空白对照组阻抗值。SB203850组与DHA+SB203850组比较,DHA+SB203850组阻抗值明显减低,差值有统计学意义(4h p<0.05.8h p<0.01,12h p<0.05)。DHA组与DHA+SB203850组相比,4h,8h,12h两组间阻抗值减少百分比均无显著统计学差异(p>0.05)。结论双氢青蒿素抑制内皮细胞迁移独立于p38 MAPK信号通路。意义1.本研究首次探讨信号通路对双氢青蒿素作用内皮细胞迁移的影响机制,证实双氢青蒿素独立于p38 MAPK信号传导通路抑制内皮细胞迁移,为双氢青蒿素抑制动脉粥样硬化易损斑块血管新生提供理论依据。2.本课题引用国际先进的细胞电子阻抗传感动态分析系统,能够实时、定量监测内皮细胞伤痕愈合过程中迁移细胞阻抗变化,实验结果具有高度可重复性,精确性,使本研究达到国际领先水平。