论文部分内容阅读
目的在裸鼠体内利用RNA干扰(RNAi)技术研究裸鼠结直肠癌移植瘤内敲低增殖诱导配体(APRIL)基因后对移植瘤的抑制影响,以及APRIL基因对人结直肠癌的促细胞增殖、侵袭转移、凋亡抑制作用。方法建裸鼠SW480结直肠癌肿瘤模型,瘤块内注射APRIL的小干扰RNA(siRNA),仔细观察裸鼠的生存状况、移植瘤的出现和生长情况。实验结束后取出皮下瘤块,利用PCR和免疫组织化学(IHC)链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法分别检测APRIL siRNA对APRIL mRNA和蛋白表达的下调作用。为了检测APRIL siRNA对移植瘤的活性的影响,IHC SP两步法检测移植瘤内增殖细胞核抗原(PCNA和Ki67),分析APRIL表达下调对移植瘤增殖的影响;IHC SP法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9),观察对移植瘤转移活性的影响;检测凋亡抑制蛋白(bcl-2蛋白和bcl-xl蛋白)用以评价APRIL siRNA对SW480移植瘤凋亡活性的影响,原位末端标记法(TUNEL)法检测肿瘤细胞凋亡变化;HE染色方法检测APRIL siRNA对移植瘤坏死的影响。此外,先获得APRIL siRNA稳定转染的SW480细胞株和pGC-vector稳定转染的SW480细胞株,然后将稳定转染的和未转染的SW480细胞移植到BALB/c裸鼠体内,仔细观察裸鼠移植瘤的发生发展,实验结束取出移植瘤检测APRIL siRNA对移植瘤的抑制作用。结果荧光定量PCR方法检测APRIL的mRNA与18S rRNA的比值分别为APRIL siRNA组(0.13±0.05)×10-3、空载体组(0.95±0.04)×10-3、PBS对照组(0.96±0.5)×10-3,在APRIL siRNA组,APRIL mRNA较PBS组降低了(86.45±0.50)%,APRIL蛋白降低了(87.5±5.0)%(P<0.05)。APRIL siRNA组SW480移植瘤生长缓慢,瘤块体积和重量明显降低,P<0.05。APRIL siRNA (sh637和sh1750)组肿瘤生长抑制率(IR)为(55.1±1.4)%。APRIL siRNA(sh637和sh1750)组PCNA比PBS组平均降低了(56.5±2.0) %,APRIL siRNA(sh637和sh1750)Ki67比PBS组平均降低了(86.80±0.70)%,MMP-2和MMP-9蛋白表达(sh637和sh1750)组比PBS组平均降低了(80.50±0.30)%和(79.8±0.50)%,APRIL siRNA(sh637和sh1750)组bcl-2和bcl-xl蛋白分别平均降低了(82.6±4.5)%和(79.2±3.5)%,P<0.05。TUNEL结果显示APRIL siRNA组凋亡细胞明显增多,凋亡率增高。稳定转染了APRIL siRNA(sh637)的SW480细胞株,移植瘤出现时间较未转染组较晚,且移植瘤的生长速度缓慢。各组移植瘤内的增殖(Ki67和PCNA)、侵袭(MMP-2和MMP-9)和凋亡抑制(bcl-2和bcl-xl)等指标检测结果与实验一相一致,稳定转染APRIL siRNA的SW480移植瘤内这些检测指标均较对照组移植瘤内低表达,P<0.05。两个实验均证实APRIL siRNA降低了裸鼠移植瘤内APRIL表达,抑制了SW480在裸鼠体内的增殖和侵袭转移,促进了细胞凋亡,从而导致了SW480移植瘤的抑制作用。结论APRIL siRNA抑制了SW480结直肠癌移植瘤的生长、增殖、转移,促进了细胞凋亡。证实了APRIL对结直肠癌的重要作用,APRIL有望作为结直肠癌治疗的靶点。