卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,因其恶性程度高,发病隐匿,进展迅速,所以其致死率居妇科肿瘤的第一位。由于缺乏特异性的筛查手段,大部分病人发现时已经出现转移,直接影响患者的生存。对于晚期患者主要是实行肿瘤细胞减灭术,术后辅以顺铂为主的化疗。而我们面临的主要问题是肿瘤的复发和化疗耐药。虽然近年来手术技巧得到提高,但术后5年生存率未见明显提高,化疗后产生的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)严重影响治疗效果,所以我们要迫切的解决卵巢癌复发和化疗耐药问题,通过遏制肿瘤细胞的侵袭能力和增强肿瘤细胞对药物的敏感性来达到临床治疗效果。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymcrase-1, PARP-1)是广泛存在于多数真核细胞核内的单体蛋白酶,PARP-1参与调节细胞的分化、增殖、肿瘤的转化以及DNA损伤的修复。研究表明,PARP-1在多种恶性肿瘤细胞中高表达,在卵巢癌中也是如此,由此我们认为PARP-1可能参与了肿瘤的侵袭和转移。而EMT在上皮源性肿瘤细胞的侵袭转移中发挥重要作用,因此我们分析PARP-1和EMT在卵巢癌的发生中可能存在某种联系。DNA损伤修复能力增强是化疗耐药的重要原因,当肿瘤细胞受到细胞毒性抗肿瘤药物作用后,引起DNA损伤,可降低对化疗的敏感性。因此我们设想,抑制PARP-1后,肿瘤细胞对顺铂的敏感性会增强。基于此,本项目拟通过建立PARP-1基因转染稳定表达的卵巢癌SKOV3细胞株,对其生物学特性进行体外研究,观察其对侵袭及EMT的影响；通过体外实验观察RNA干扰抑制PARP-1后对顺铂敏感性的影响；通过建立裸鼠卵巢癌模型,通过体内实验,观察RNA干扰抑制PARP-1后对顺铂敏感性的影响；为卵巢癌的靶向治疗提供理论及实验依据。第一部分：RNA干扰抑制PARP-1对卵巢癌SKOV3细胞EMT的逆转研究研究目的：1.建立PARP-1基因转染稳定表达的卵巢癌SKOV3细胞株。2.探讨干扰抑制PARP-1基因对卵巢癌SKOV3细胞侵袭的影响。3.探讨干扰抑制PARP-1基因对卵巢癌SKOV3细胞上皮间质转化的逆转作用。研究方法：1.细胞的转染及稳定转染细胞株的筛选(PCR 和 Western-blot)。2. Transwell小室法侵袭实验,检测干扰抑制PARP-1对SKOV3细胞侵袭能力的影响。 3. Western-blot检测干扰抑制PARP-1后对E-cadherin和Vimentin表达的影响。结果：1.SKOV3细胞转染后转染效率荧光显微镜下观察到绿色荧光(GFP)视为转染成功,我们分别于转染后12小时、24小时、36小时、72小时进行荧光计数,比较荧光细胞的数量,随着时间的延长,于72小时GFP的表达最高,SKOV3细胞的转染效率在90%以上。2. RT-PCR测定转染72h后目的基因PARP-1mRNA的表达与未转染组、NcSiRNA组相比,转染后PARP-1mRNA的表达明显降低,PARP-1 siRNA1下降了38%,差异具有显著性(P<0.05)；而PARP-1 SiRNA2下降了81%,差异具有显著性(P<0.01)。表明PARP-1 SiRNA能够抑制目的基因PARP-1的表达水平,达到干扰效果。3. Western blot检测转染72h后目的基因PARP-1蛋白的表达与未转染组、NcSiRNA组相比,转染后PARP-1蛋白的表达明显降低,PARP-1 siRNA1下降了12%,(P<0.05)；而PARP-1 SiRNA2下降了44%,与其它三组相比,(P<0.01)。转染后PARP-1 SiRNA2组蛋白表达水平最低,与RT-PCR检测结果相符。说明PARP-1 SiRNA2是最有效和最特异的序列,可以用于干扰抑制PARP-1基因,所以我们用来进行后续实验。4. PARP-1 SiRNA转染对SKOV3细胞侵袭能力的影响通过Transwell小室法侵袭实验,检测干扰抑制PARP-1后,对未转染组、NcSiRNA组和PARP-1 SiRNA组三组细胞侵袭能力的影响,显微镜下观察侵袭细胞数目。与未转染组、NcSiRNA组相比,PARP-1 SiRNA转染组侵袭细胞数目明显减少(P<0.05),而未转染组和NcSiRNA组之间比较,侵袭细胞数目无统计学差异(P>0.05)。结果表明SKOV3细胞干扰抑制：PARP-1后,能使肿瘤细胞的侵袭性明显降低,表明PARP-1参与了卵巢癌SKOV3细胞侵袭的发生。5.Western-blot检测PARP-1SiRNA转染后对E-cadherin和Vimentin表达的影响与未转染组、NcSiRNA组相比,PARP-1SiRNA转染组E-cadherin的表达明显升高(P<0.05),而未转染组和NcSiRNA组之间E-cadherin的表达比较无明显差异(P>0.05)。我们也看到,与未转染组、NcSiRNA组相比,PARP-1SiRNA转染组Vimentin的表达显著降低(P<0.05),而未转染组、NcSiRNA组中Vimentin的表达无明显差异(P>0.05)。结果表明SKOV3细胞干扰抑制PARP-1后,能使EMT发生逆转。结论：1.干扰抑制PARP-1,能明显的降低卵巢癌SKOV3细胞的侵袭。2.干扰抑制PARP-1,能使EMT发生逆转。3.PARP-1蛋白的表达可能与卵巢癌侵袭和EMT的发生有关。通过Transwell小室法侵袭实验,检测干扰抑制PARP-1后,对未转染组、NcSiRNA组和PARP-1 SiRNA组三组细胞侵袭能力的影响,显微镜下观察侵袭细胞数目。与未转染组、NcSiRNA组相比,PARP-1 SiRNA转染组侵袭细胞数目明显减少(P<0.05),而未转染组和NcSiRNA组之间比较,侵袭细胞数目无统计学差异(P>0.05)。结果表明SKOV3细胞干扰抑制：PARP-1后,能使肿瘤细胞的侵袭性明显降低,表明PARP-1参与了卵巢癌SKOV3细胞侵袭的发生。5.Western-blot检测PARP-1SiRNA转染后对E-cadherin和Vimentin表达的影响与未转染组、NcSiRNA组相比,PARP-1SiRNA转染组E-cadherin的表达明显升高(P<0.05),而未转染组和NcSiRNA组之间E-cadherin的表达比较无明显差异(P>0.05)。我们也看到,与未转染组、NcSiRNA组相比,PARP-1SiRNA转染组Vimentin的表达显著降低(P<0.05),而未转染组、NcSiRNA组中Vimentin的表达无明显差异(P>0.05)。结果表明SKOV3细胞干扰抑制PARP-1后,能使EMT发生逆转。结论：1.干扰抑制PARP-1,能明显的降低卵巢癌SKOV3细胞的侵袭。2.干扰抑制PARP-1,能使EMT发生逆转。3.PARP-1蛋白的表达可能与卵巢癌侵袭和EMT的发生有关。第二部分：RNA干扰抑制PARP-1对顺铂敏感性影响的体外研究研究目的：1.探讨PARP-1受到干扰抑制,对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。2.探讨PARP-1受到干扰抑制,顺铂对SKOV3细胞增殖的影响。3.探讨PARP-1受到干扰抑制,顺铂对SKOV3细胞凋亡、细胞周期及ERK1/2信号通路的作用。研究方法：1.细胞集落实验观察干扰抑制PARP-1,细胞集落的变化。2.通过CCK8法观察不同浓度下顺铂对SKOV3细胞细胞活性的影响。3.通过流式细胞术和Hoechst 33258染色观察干扰抑制PARP-1, SKOV3细胞凋亡的变化,通过流式细胞术检测细胞周期的变化,Western-blot检测干扰抑制PARP-1后对ERK信号通路表达的影响。结果：1.干扰抑制PARP-1对SKOV3细胞增殖的影响细胞集落实验结果表明,转染PARP-1SiRNA后SKOV3细胞的集落形成能力受到明显抑制,细胞生长速度减慢,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05),说明干扰抑制PARP-1蛋白的表达,会影响到卵巢癌SKOV3细胞的增殖活性。2.干扰抑制PARP-1的表达,顺铂对SKOV3细胞增殖活性的影响CCK8实验表明,PAPR-1SiRNA组细胞和NcSiRNA对照组细胞的细胞活性均随顺铂浓度的增高而逐渐降低。细胞活性随着顺铂的治疗呈剂量依赖性,下调PARP-1的表达,在顺铂的作用下,细胞活性明显降低。两者的差异有统计学意义(P<0.05),说明干扰抑制PARP-1的表达,能增加顺铂对卵巢癌SKOV3细胞的敏感性,使SKOV3细胞的增殖能力明显降低。3.观察Hoechst33258荧光染色细胞形态学变化以及SKOV3细胞凋亡的检测我们发现,PAPR-1SiRNA组细胞经顺铂处理后凋亡细胞的细胞形态发生改变,NcSiRNA组细胞核经染色后,细胞核染色略淡且分布均匀,PARP-1SiRNA组中凋亡细胞的数量较前增多,经与顺铂联用后荧光显微镜下可看到细胞核呈浓染蓝光、表现为细胞固缩的特征,且凋亡细胞的数量明显增多。PAPR-1SiRNA组和NcSiRNA对照组相比,两者的差异有统计学意义(P<0.05),说明干扰抑制PARP-1的表达,能增强顺铂对细胞的化学毒性作用,使SKOV3细胞的凋亡增加。干扰抑制PARP-1的表达后,细胞凋亡率略有增加,差异有统计学意义(P<0.05),而PARP-1SiRNA组+顺铂处理后细胞的凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。提示PAPR-1SiRNA能增强顺铂对SKOV3细胞的促凋亡作用。4.细胞周期分析各分组在细胞周期中各期细胞的分布有差异,干扰抑制：PARP-1后,G0/G1期细胞略有增加,S期细胞略有减少,用顺铂处理NcSiRNA后,细胞周期分布在G0/G1期细胞较NcSiRNA组和PARP-1SiRNA组增多,说明单纯的PARP-1干扰后对细胞周期的影响不明显。而干扰抑制]PARP-1后,顺铂作用48小时后,细胞周期呈明显的G0/G1期阻滞,同时S期与G2/M期细胞分布减少。5.Western blot结果分析分别向PAPR-1SiRNA和NcSiRNA细胞作用中加入10uM顺铂作用48h,我们发现,顺铂抑制了ERK的磷酸化,而干扰抑制了PAPR-1的表达后,pERK1/2表达更低,但总的ERK1/2表达未受影响。说明干扰抑制PAPR-1的表达后,能增强顺铂对ERK1/2信号通路的抑制作用。6.U0126对顺铂作用后细胞活性的影响U0126是ERK特异性抑制剂,我们先用10uM的U0126作用于细胞2h,然后加入10uM顺铂,发现当我们阻断ERK1/2信号通路后,PAPR-1SiRNA组细胞活性明显降低,以上结果表明,U0126作用后能有效增强PAPR-1SiRNA介导的SKOV3细胞对顺铂的敏感性。结论：1.干扰抑制PARP-1的表达,能使SKOV3细胞的增殖能力下降。2.干扰抑制PARP-1的表达,能使顺铂对SKOV3细胞的毒性增强,降低SKOV3细胞的细胞活性,能在一定程度上降低顺铂对SKOV3细胞的耐药性。3.转染小干扰RNA后,PAPR-1SiRNA能使SKOV3细胞的细胞形态发生改变,凋亡比例上升,在顺铂的作用下,凋亡细胞数目明显增多,干扰抑制PAPR-1能增强顺铂对SKOV3细胞的促凋亡作用。分别向PAPR-1SiRNA和NcSiRNA细胞作用中加入10uM顺铂作用48h,我们发现,顺铂抑制了ERK的磷酸化,而干扰抑制了PAPR-1的表达后,pERK1/2表达更低,但总的ERK1/2表达未受影响。说明干扰抑制PAPR-1的表达后,能增强顺铂对ERK1/2信号通路的抑制作用。6.U0126对顺铂作用后细胞活性的影响U0126是ERK特异性抑制剂,我们先用10uM的U0126作用于细胞2h,然后加入10uM顺铂,发现当我们阻断ERK1/2信号通路后,PAPR-1SiRNA组细胞活性明显降低,以上结果表明,U0126作用后能有效增强PAPR-1SiRNA介导的SKOV3细胞对顺铂的敏感性。结论：1.干扰抑制PARP-1的表达,能使SKOV3细胞的增殖能力下降。2.干扰抑制PARP-1的表达,能使顺铂对SKOV3细胞的毒性增强,降低SKOV3细胞的细胞活性,能在一定程度上降低顺铂对SKOV3细胞的耐药性。3.转染小干扰RNA后,PAPR-1SiRNA能使SKOV3细胞的细胞形态发生改变,凋亡比例上升,在顺铂的作用下,凋亡细胞数目明显增多,干扰抑制PAPR-1能增强顺铂对SKOV3细胞的促凋亡作用。第三部分：RNA干扰抑制PARP-1顺铂敏感性影响的体内研究研究目的：1.建立卵巢癌的裸鼠模型。2.探讨裸鼠抑制PARP-1 SiRNA对顺铂化疗敏感性的影响。3.探讨卵巢癌裸鼠瘤PARP-1受到干扰抑制后顺铂对卵巢癌增殖的影响。研究方法：将每只裸鼠一侧协腹部皮下注入浓度为1×107个/m1卵巢癌SKOV3细胞100ul,成功建立卵巢癌裸鼠模型,当裸鼠移植瘤直径不小于5mm时,将20只瘤鼠随机分成空白对照组、单纯顺铂组、顺铂+NcSiRNA组、顺铂+PARP-1 SiRNA组,每组5只裸鼠。空白对照组：给予腹腔注射100μl生理盐水,隔72h1次,共3次；单纯顺铂组：给予腹腔注射顺铂2mg/kg,隔72h1次,共3次；顺铂+NcSiRNA组：每次腹腔注射顺铂的同时,注入慢病毒阴性载体NcSiRNA(病毒含量1×109pfu)0.1ml;顺铂+PARP-1SiRNA组：每次腹腔注射顺铂的同时,注入慢病毒PARP-1SiRNAi(病毒含量1×109pfu)0.1ml。每3天测量移植瘤1次,计算肿瘤体积和重量；观察RNA干扰PARP-1后及顺铂干预治疗后对移植瘤瘤体的影响；利用免疫组化检测增殖指标Ki67在各个分组中的表达,观察顺铂作用后细胞的增殖情况。结果：1.裸鼠接种卵巢癌SKOV3细胞后,反应正常,处于潜伏期生长的肿瘤一般在2周左右,连续观察肿瘤形态,早期肿瘤包块形态稍规则,后期包块形态欠规则,质地稍硬,与周围边界欠清(图1)。4周后处死裸鼠,立即将病灶切除,制作病理切片,HE染色,观察卵巢癌裸鼠细胞的镜下特点(图2),可见卵巢癌细胞大小不一,形状不一,细胞核较大,间质水肿,细胞异型性明显,证实成功建立卵巢癌裸鼠瘤模型。2.为研究PARP-1 SiRNA组化疗后对己形成的裸鼠卵巢癌移植瘤的生长的作用,我们通过建立起裸鼠皮下移植瘤模型,对照组给予腹腔注射生理盐水,在移植瘤内注射PARP-1 SiRNA病毒和NcSiRNA病毒,同时腹腔给予顺铂,发现注射PARP-1 SiRNA病毒生长速度较NcSiRNA病毒减慢,且肿瘤的体积缩小。28天后空白对照组裸鼠抑制瘤的平均体积是576mm3,单纯顺铂处理组的体积是339mm3,顺铂+NcSiRNA处理组裸鼠抑制瘤的平均体积为341mm3；而顺铂+PARP-1SiRNA组裸鼠移植瘤的平均体积为213mm3。空白对照组移植瘤的肿瘤为1.0g,顺铂+NcSiRNA组和单纯顺铂组裸鼠移植瘤的平均重量分别为0.57g、0.56g；而顺铂+PARP-1SiRNA组移植瘤的平均重量为0.21g。顺铂+PARP-1SiRNA组在肿瘤体积和肿瘤的重量与其它三组比较,差异有显著性(P<0.05)。单纯顺铂组、顺铂+NcSiRNA组裸鼠移植瘤的平均抑瘤率分别是33.6%,32.3%,而顺铂+PARP-1SiRNA组裸鼠移植瘤的平均抑瘤率是59.4%,与前两组相比,差异有显著性(P<0.05)。3.免疫组化示：经治疗后,PARP-1SiRNA化疗组移植瘤组织中Ki67蛋白的表达明显降低。结论：RNA干扰抑制PARP-1在体内能够显著提高卵巢癌顺铂化疗的敏感性。