背景:结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率在男性和女性肿瘤患者中分别位居第三位和第二位,死亡率仅次于肺癌和肝癌[1],严重危害人类的健康及生命。尽管近几来在发达国家结直肠癌的发病率和致死率已出现下降趋势,但目前在我国仍呈现上升趋势,且确诊患者以中晚期多见[6]。目前结直肠癌的治疗方法主要是以手术根治性切除为主,对于进展期的病人,手术后通常接受以化疗为主的综合治疗。然而令我们遗憾的是来自全球多中心的大数据结果显示,虽然经过规范的抗肿瘤综合治疗,全球每年仍有数十万人死于结直肠癌。其原因是由于结直肠癌对多种化疗药存在广泛的耐药性,同时化疗带来的毒副作用,严重影响了患者的生活质量,浪费大量的医疗资源,因此筛选高效、低毒副作用的抗肿瘤药物和发现有效的治疗靶点是当务之急。micro RNA(mi RNA)是一种小型的,具有调控功能的,由19~25个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA[66],mi RNA基因表达具有以下几个特点:即高度的稳定性、肿瘤相关性和组织特异性[67],上述的特点使mi RNA可能成为潜在的生物标志物。mi RNA是细胞功能和体内平衡的主要调节因子,在细胞分化、新陈代谢和肿瘤的生成过程中发挥重要作用。异常的mi RNA的表达可以直接促进或抑制下游靶基因的转录表达,发挥着癌基因或抑癌基因的功能,进而影响结直肠癌的病程进展[82-84]。目前针对mi RNA研究的主要难点是靶基因的预测和生物功能的评价,mi RNA究竟在结直肠癌发生、发展过程中如何发挥调节作用需进一步探讨,选择合适肿瘤相关基因作为靶点,对肿瘤进行特异性治疗,已成为肿瘤治疗的研究热点。文献报道,人们已经发现mi R-491在多种肿瘤中,如胶质细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肾上腺癌、宫颈癌等,发挥调控癌细胞增殖、凋亡、侵袭转移及耐药性的作用[87-89]。此外,mi R-491的异常升高与结直肠癌的侵袭和转移状况有关,通过特异性抑制剂来下调mi R-491的表达能够增加化疗药物对动物模型的敏感性。虽然目前研究能够表明mi R-491与结直肠癌的发生和预后密切相关,但是对于其调控机制尚不明确。PEG10是一种父系表达的遗传印记基因[95],已经被证实是癌基因,可以调节细胞生长和分化,并可促进肿瘤细胞的生长和增殖。国外有学者研究发现,IGF-2(印记基因胰岛素样生长因子2)在大部分结直肠癌中通过甲基化而呈现过度表达状态,导致肿瘤细胞的增殖、分化,进而促进肿瘤的发生、发展,因此我们推测与IGF-2为同源性的父系表达基因PEG10在结直肠癌中也呈现过度表达状态[109-110]。Wnt基因在各种生物中都的高度保守,不存在于正常成熟的细胞中。其中Wnt1可能是导致经典Wnt信号通路激活的始动因素之一。β-catenin是新原癌基因的产物,在结直肠癌中处于高表达,而正常的结直肠上皮细胞中没有游离的β-catenin。研究表明,在结直肠癌细胞中,由于Wnt/β-catenin突变及异常活化[63],导致其不能被降解,结果引起细胞质内大量聚积的Wnt/β-catenin转位进入细胞核,与相应的转录因子(如TCF4/LEF)结合,促进下游某些原癌基因表达,使细胞过度增殖、分化,抑制细胞凋亡,导致肿瘤发生[113]。中医药作为我国特有的医疗手段,是抗肿瘤综合治疗的重要组成部分,有其独特的优势。它可及时修复化疗药物所带来的毒副作用,提高病体正常机能,改善患者的生活质量,增加肿瘤对化疗药物的敏感性,其抗肿瘤的作用已经被广泛应用于临床中。姜黄素作为一种传统的中药成分,能够调节众多的信号转导途径,在体外细胞模型和动物模型中均被证实在结直肠癌的预防和化疗过程中有着重要的作用,目前美国国立肿瘤研究中心已经将其列为第3代肿瘤防治药物[19]。然而,到目前为止,它的抗癌作用的分子机制尚未完全明确。目的:本次研究是建立在mi RNA水平上来探讨姜黄素对结直肠癌的抗癌作用机制。在HCT-116细胞中分析了姜黄素对mi R-491,PEG10和Wnt1/β-catenin信号通路的影响,以明确姜黄素、mi R-491、PEG10、Wnt1/β-catenin调节轴在结直肠癌发展过程中的水平变化。阐述姜黄素对结直肠癌的发生发展的调控机理,为进一步研究结直肠癌的诊断和预后判断提供科学依据。在mi RNA水平上研究中医药防治结直肠癌的机制具有非常重要的意义,可以为中医药防治肿瘤提供新的分子靶点,以中西医结合的治疗方式有望提高结直肠癌患者的5年生存率。方法:实验一:我们收集自2016年6月至2017年1月在吉林大学第一医院结直肠肛门外科经手术切除的结直肠癌组织和相应的癌旁组织(距肿瘤组织≥5cm)标本。应用q PCR技术检测mi R-491、PEG10、Wnt1和β-catenin m RNA的表达情况。同时应用Western blot法检测结直肠癌组织和癌旁组织中PEG10,Wnt1和β-catenin蛋白的表达水平。实验二:应用q PCR检测mi R-491在结直肠癌HCT116、Caco2、HT29细胞中的表达情况。mi R-491mimics和inhibitor合成及测序全部由上海Gene Pharma公司完成。应用双荧光素酶报告基因检测系统对mi R-491和PEG10之间的靶标关系进行验证。应用q PCR法检测HCT116细胞在分别转染mi R-491 mimics,mi R-491 inhibitor和mi R-NC后,mi R-491,PEG10,Wnt1和β-catenin m RNA的表达水平。应用Western blot法检测HCT116细胞在分别转染mi R-491 mimics,mi R-491 inhibitor和mi R-NC后,PEG10,Wnt1和β-catenin蛋白的表达水平。实验三:应用MTT法检测姜黄素及过表达PEG10对HCT116细胞增殖的影响。应用流式细胞术检测姜黄素及过表达PEG10对HCT116细胞凋亡的影响。应用q PCR法检测姜黄素组与PEG10过表达组中mi R-491,PEG10,Wnt1和β-catenin m RNA的表达水平。应用Western blot法检测姜黄素组、PEG10过表达组及阴性对照组中PEG10,Wnt1和β-catenin蛋白的表达水平。通过皮下接种HCT116细胞建立免疫缺陷小鼠异种移植瘤模型。腹腔注射姜黄素,给药5周,观察肿瘤生长情况。应用MTT法检测姜黄素对HCT116细胞增殖的影响。应用流式细胞术检测姜黄素对HCT116细胞凋亡的影响。应用q PCR法检测HCT116细胞转染mi R-491 inhibitor与转染mi R-491 inhibitor+姜黄素及阴性对照组相比PEG10、Wnt1和β-catenin m RNA的表达水平。应用Western blot法检测HCT116细胞转染mi R-491 inhibitor与转染mi R-491 inhibitor+姜黄素及阴性对照组相比PEG10、Wnt1和β-catenin蛋白的表达水平。结果:实验一:应用q PCR检测结果表明,在结直肠癌组织中的mi R-491表达水平显著低于癌旁组织,而PEG10,Wnt1和β-catenin m RNA表达水平显著高于癌旁组织(**P<0.01)。应用Western blot法检测结果得到与m RNA检测结果相似的变化趋势,结直肠癌组织中的PEG10,Wnt1和β-catenin蛋白表达水平均显著高于它们在癌旁组织中的表达。实验二:结果表明mi R-491在HCT116细胞中表达水平下降程度低于在其它结直肠癌细胞中下降程度,能够进行后续的体外实验研究,因此本研究采用HCT116细胞作为体外实验细胞模型。采用Mi RBase和Target Scan等生物信息学网站预测出PEG10是mi R-491潜在的下游靶基因。双荧光素酶报告基因检测结果提示mi R-491能通过PEG10的3’UTR区的结合位点相结合,从而抑制PEG10的表达,使荧光素酶活性降低,进一步证实了PEG10为mi R-491的下游靶基因。应用q PCR法检测在HCT116细胞转染mi R-491 mimics与转染mi R-491 inhibitor或mi R-NC后相比mi R-491的表达可以显著上调。PEG10 m RNA在转染mi R-491 mimics后表达显著减少,mi R-491 inhibitor可明显增加PEG10 m RNA的表达水平。在mi R-491mimics组的Wnt1和β-catenin m RNA的表达水平下调,而mi R-491 inhibitor可显著增加Wnt1和β-catenin m RNA的表达水平。在HCT116细胞转染miR-491 mimics与转染mi R-491 inhibitor或miR-NC后相比较,PEG10、Wnt1和β-catenin蛋白在mi R-491 mimics组里显著减少,而mi R-491inhibitor可明显增加PEG10、Wnt1和β-catenin蛋白的表达水平。实验三:MTT检测结果显示姜黄素可以明显降低HCT116细胞的活力,PEG10过表达后可显著增加HCT116细胞的活力。流式细胞术检测结果表明姜黄素可诱导HCT116细胞凋亡,而PEG10过表达后可显著降低HCT116细胞的凋亡率。与对照组相比,肿瘤体积和重量均下降,差异具有统计学意义,该结果表明姜黄素在小鼠体内能抑制肿瘤生长。应用q PCR法检测结果表明姜黄素可以上调mi R-491的表达水平,同时下调PEG10、Wnt1和β-catenin m RNA的表达。过表达PEG10后,能够显著提高Wnt1和β-catenin的m RNA的表达。应用Western blot检测结果表明PEG10过表达组使PEG10、Wnt1和β-catenin蛋白的表达水平的增加,而姜黄素可以使PEG10、Wnt1和β-catenin蛋白的表达水平降低。MTT检测结果显示在mi R-491被抑制后,姜黄素可以明显降低HCT116细胞的活力,表明姜黄素能够减少HCT116细胞的增殖。流式细胞术检测结果表明mi R-491被抑制后,姜黄素可诱导HCT116细胞凋亡。应用q PCR法检测HCT116细胞转染mi R-491 inhibitor组中PEG10、Wnt1和β-catenin m RNA的表达水平与转染mi R-491 inhibitor+姜黄素及阴性对照组相比显著上升。HCT116细胞转染mi R-491 inhibitor+姜黄素与转染mi R-491 inhibitor相比PEG10、Wnt1和β-catenin m RNA的表达水平明显下降。应用Western blot检测在HCT116细胞转染mi R-491 inhibitor后PEG10、Wnt1和β-catenin蛋白表达水平明显升高,而HCT116细胞转染mi R-491 inhibitor+姜黄素与转染mi R-491 inhibitor相比PEG10、Wnt1和β-catenin蛋白表达水平明显下降。结论:实验一:(1)本实验采用实时荧光定量PCR检测结果表明mi R-491在癌旁组织中的表达显著高于其在结直肠癌组织中的表达,证实mi R-491在结直肠癌的发生、发展过程中起到“抑癌基因”的作用。(2)无论在RNA水平还是在蛋白水平,在结直肠癌组织中的PEG10,Wnt1和β-catenin表达均显著高于癌旁组织,表明PEG10,Wnt1和β-catenin在结直肠癌的发生、发展过程中起到一定的促进作用。(3)mi R-491的表达与PEG10,Wnt1和β-catenin mRNA表达水平呈负相关。实验二:(1)与其它结直肠癌细胞相比,mi R-491在HCT116细胞中表达水平下降程度最为显著。(2)本次实验通过基因预测程序预测PEG10是mi R-491的靶基因,并通过双荧光素酶报告系统验证了mi R-491与PEG10之间互作的靶标关系,证实了PEG10是mi R-491的下游靶基因。(3)构建mi R-491过表达及沉默模型,当mi R-491过表达后能够抑制PEG10以及Wnt1和β-catenin m RNA及蛋白的表达,而沉默mi R-491能够促进PEG10,Wnt1和β-catenin m RNA及蛋白的表达,进一步说明了mi R-491对PEG10、Wnt1和β-catenin的负性调控作用。实验三:(1)从MTT比色法和流式细胞术的实验结果中看出,姜黄素能够抑制体外培养的HCT116细胞的增殖,促进HCT116细胞的凋亡;在小鼠体内成瘤实验能发现姜黄素能够抑制体内肿瘤生长;而且在mi R-491沉默后,姜黄素仍可产生上述效应,并可促进mi R-491的表达;PEG10过表达后可促进HCT116细胞的增殖,抑制HCT116细胞的凋亡。(2)Wnt1及β-catenin是PEG10的下游信号分子。mi R-491对结直肠癌的抗肿瘤作用是通过对PEG10的调控,进而发挥对Wnt1/β-catenin信号通路的调节作用来实现的。(3)姜黄素能够有效促进mi R-491的表达,抑制PEG10、Wnt1和β-catenin m RNA和蛋白的表达。因此姜黄素对结直肠癌的抗癌作用可以通过上调mi R-491表达,从而降低PEG10的表达,进而抑制Wnt1/β-catenin信号通路而实现的。(4)本研究是在mi RNA水平上来研究传统中药姜黄素的抗肿瘤作用机制,并首次报道姜黄素对mi R-491、PEG10的调节作用,有望成为抗结直肠癌治疗的新靶点,并为抗结直肠癌药物的研发提供新的思路和方向。