肾母细胞瘤(nephroblastoma),又称 Wilm’s 瘤(Wilm’s tumor,WT),是儿童最常见的原发性肾脏恶性肿瘤,手术、化疗和放疗的综合治疗对大多数肾母细胞瘤效果良好,使其5年生存率已经超过了 85%。卡铂(carboplatin)作为第二代铂类抗肿瘤药物,与顺铂相比,具有较小的肾毒性,主要用于复发的或初始化疗失败的肾母细胞瘤患儿的治疗。但是,由于卡铂在肿瘤组织中摄取率较低,大部分药物短时间内即经尿液排出,影响了其抗肿瘤作用。近年来,为提高铂类药物的抗肿瘤效果和降低其毒副作用,关于铂类药物纳米转运载体的研究越来越多。壳聚糖是自然界中唯一的碱性多糖,具有良好的生物相容性和可降解性,其聚合物纳米颗粒作为药物转运载体,具有靶向、缓释、增加药物吸收、提高药物疗效等作用。因此,为增强卡铂对肾母细胞瘤的治疗效果,我们以壳聚糖为原料,制备负载卡铂的壳聚糖纳米颗粒,同时考察其理化性质,并以SK-NEP-1细胞为细胞模型,通过体外实验评价卡铂-壳聚糖纳米颗粒对肾母细胞瘤的抑制作用。目的:1.制备卡铂-壳聚糖纳米颗粒,考察其外观形态、粒径分布、载药量、包封率和体外释药等理化性质。2.体外实验评价卡铂-壳聚糖纳米颗粒对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞的抑制作用。方法:1.通过离子凝胶法制备卡铂-壳聚糖纳米颗粒,透射电子显微镜和原子力显微镜观察其形态,激光粒度仪测定其粒径分布情况;高效液相色谱法测定壳聚糖纳米颗粒对卡铂的包封率及载药量;以PBS缓冲液为体外释药介质,高效液相色谱法测定研究卡铂-壳聚糖纳米颗粒体外释药特性。2.将不同浓度的卡铂和卡铂-壳聚糖纳米颗粒加入到细胞培养液中,孵育肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞至设定时间,光学显微镜观察各组细胞形态学的变化;台盼蓝拒染法和MTT法检测卡铂-壳聚糖纳米颗粒对SK-NEP-1细胞存活率的影响;平板细胞克隆形成试验检测卡铂壳聚糖纳米颗粒对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞集落形成能力的影响;Hoechst法和TUNEL法检测卡铂-壳聚糖纳米颗粒对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞凋亡的影响。结果:1.制备的卡铂-壳聚糖纳米颗粒在透射电子显微镜下呈球形或类球形,大小均一,彼此之间具有清楚的边界;原子力显微镜成像进一步证实了该纳米颗粒是圆形的,并且在云母表面看起来呈扁平状;激光粒度仪测得卡铂-壳聚糖纳米颗粒平均粒径约160nm(160±20.5nm),分布较集中。2.卡铂的加入量可影响壳聚糖纳米颗粒对其的包封率,卡铂的加入量为壳聚糖纳米颗粒量的3%时,包封率最大为92.7%;卡铂的加入量为壳聚糖纳米颗粒量的25%时,包封率迅速下降至44.2%。卡铂的加入量为5%,8%,15%时,负载卡铂的壳聚糖纳米颗粒的包封率无明显差异(P>0.05);卡铂的加入量为15%和25%时,负载卡铂的壳聚糖纳米颗粒的包封率差异有显著性意义(P<0.01)。3.卡铂从壳聚糖纳米颗粒中释放可分为三个阶段:快速释放、均匀释放和缓慢释放。快速释放阶段为用药后24小时内纳米颗粒药物释放量可达51.2%;均匀释放阶段为用药后的第2-4天;在第4天以后药物进入缓慢释放阶段,并持续至少2天以上。4.光学显微镜下观察到未被药物处理的对照组SK-NEP-1细胞保持它们典型的形态,并均匀分布在整个盖玻片上;游离卡铂处理的SK-NEP-1细胞形态不规则,且细胞数量减少。卡铂-壳聚糖纳米粒子处理过的SK-NEP-1细胞80%以上不贴壁,且其余的细胞皱缩呈圆形。5.台盼蓝拒染法结果表明卡铂和卡铂-壳聚糖纳米颗粒对SK-NEP-1细胞均显示出明显的抑制作用,且卡铂-壳聚糖纳米颗粒对肿瘤细胞中的抑制作用大于游离卡铂制剂(P<0.05)。在10μg/mL药物浓度下,各组细胞经相应药物作用24小时后,卡铂-壳聚糖纳米颗粒组细胞生长减少了约80%,而游离卡铂组细胞生长只减少了约40%。6.MTT法显示卡铂-壳聚糖纳米颗粒对SK-NEP-1细胞具有强烈的剂量依赖性细胞毒性作用,且这种作用明显大于游离卡铂。在1μg/mL的药物浓度下,游离卡铂组和卡铂-壳聚糖纳米颗粒组的细胞存活率分别保持在72%和56%;在10μg/mL浓度下,卡铂组和卡铂-壳聚糖纳米颗粒组的细胞存活率分别保持在34%和 18%。7.平板细胞克隆形成试验表明不含药物的对照组SK-NEP-1细胞集落形成没有受到抑制,被卡铂及卡铂-壳聚糖纳米颗粒处理的SK-NEP-1细胞集落形成能力受到显著抑制,且后者作用更强。具体而言,SK-NEP-1细胞经相应药物处理14天后卡铂-壳聚糖纳米颗粒组显示出70%的细胞集落形成的能力受到抑制,而卡铂组仅显示出35%的能力受到抑制。8.Hoechst染色法和TUNEL法检测结果表明,与未被处理的对照组相比,被卡铂-壳聚糖纳米颗粒处理的SK-NEP-1细胞显示出更多的凋亡特征。具体表现为对照组细胞的荧光强度弱,而卡铂和卡铂-壳聚糖纳米颗粒处理的细胞显示出标志细胞凋亡的荧光强度显著增强。定量数据进一步显示卡铂-壳聚糖纳米颗粒组显示近30%的肿瘤细胞发生凋亡,游离卡铂组显示仅约15%的细胞凋亡,而对照组显示凋亡的细胞仅约2%。结论:1.采用离子凝胶法制备的卡铂-壳聚糖纳米颗粒大小形态均匀,且具有较好的载药和释药特性。2.在体外实验条件下卡铂-壳聚糖纳米颗粒对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞具有较强的抑制作用,且比游离卡铂的作用更强。