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细胞色素P450单加氧酶系是一个由含血红素的蛋白组成的超家族,在调节昆虫和植物的相互关系中起着非常重要的作用。所有的植物都会利用P450s合成有毒的防御化合物(如植物次生物质),而植食性昆虫也利用P450s代谢这些植物次生物质。植食性昆虫取食植物时通过感觉和转导寄主植物的防御信号,特别是植物次生物质防御信号,不断地调节自身反防御系统——细胞色素P450酶系去应对不断增强的植物防御。昆虫细胞色素P450基因的可诱导性是植食性昆虫对寄主植物适应性的主要机制。然而,目前对于植食性昆虫如何接收和转导植物防御物质信号上调自身反防御系统方面大多未知。美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)是一种多食性害虫,其细胞色素P450 CYP321A1能代谢一系列的植物次生物质和杀虫剂,它的转录能被植物次生物质(包括花椒毒素xanthotoxin和黄酮flavone)高度诱导。为了更进一步理解植食性昆虫对植物次生物质信号的接收和转导机制,本论文以美洲棉铃虫的CYP321A1基因为材料,构建了系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,通过一系列瞬时转染和相对荧光素酶活性分析、RT-PCR、凝胶电泳迁移率实验(EMSA)和RNAi实验,研究内容和结果如下:为了识别在黄酮flavone诱导的美洲棉铃虫CYP321A1转录调控中发挥作用的关键调控元件,本研究利用生物信息学软件对CYP321A1基因5’侧翼序列特征进行了分析,构建了一系列不同长度片段的缺失报告基因重组载体,这些载体被瞬时转染进美洲棉铃虫脂肪体细胞,双荧光素酶报告实验系统被用来检测其活性。对启动子的3’缺失结果表明在CYP321A1基因的5’非翻译区存在正的调控元件;5’缺失结果显示,CYP321A1基因启动子区存在1个必需的调控元件,4个增强子以及2个沉默子;更进一步的5’缺失结果表明,从-109～-74的36bp区域(XRE-Fla)对CYP321A1启动子的基本活性和flavone诱导活性至关重要(翻译起始密码子ATG中的A定为+1)。该区域包含了一个TAAT反向重复(-109 to -100),一个GCT镜面重复(-99 to -93)和一个ARE-like元件(类似的抗氧化反应元件)(-92 to -74)。这些区域的缺失突变和定点突变分析表明ARE-like元件和GCT重复对CYP321A1启动子的基本活性和flavone诱导活性是必需的。TAAT反向重复仅仅对CYP321A1启动子的flavone诱导活性是必需的。EMSA分析表明,通过ARE-like元件,XRE-Fla和美洲棉铃虫脂肪体细胞的核抽提物特异性结合,并且flavone处理能增加核因子与XRE-Fla的特异性结合。这些结果都表明CYP321A1启动子的基本活性和flavone诱导活性主要被XRE-Fla调节,其次被启动子区和5’非翻译区的其他顺式作用元件调节。为了弄清楚两种具有不同化学结构的植物次生物质—花椒毒素xanthotoxin和黄酮flavone诱导CYP321A1基因的表达是否通过不同的反应元件,一系列不同片段长度的缺失报告基因重组载体、内部缺失以及定点突变的报告基因重组载体被转染进美洲棉铃虫脂肪体细胞,3’和5’缺失结果显示,在CYP321A1基因的启动子区域,存在4个正的(5’UTR, -119 to -159, -278 to -310,和-310 to -558)、2个负的(-199 to -237和-1218 to -1470)和1个必需的花椒毒素反应元件(XRE-Fla);包括必需的反应元件(XRE-Fla)在内,上面6个花椒毒素反应元件中的3个(5’UTR, -119 to -159和-1218 to -1470)也是黄酮反应元件。更进一步的缺失突变和定点突变分析表明,必需的反应元件(XRE-Fla)的三个部分以相同的模式调节黄酮、花椒毒素诱导的CYP321A1基因的表达。两种植物次生物质的增效试验表明:花椒毒素xanthotoxin和黄酮flavone诱导美洲棉铃虫CYP321A1基因的转录具有增效作用。这些结果都表明花椒毒素xanthotoxin和黄酮flavone诱导美洲棉铃虫CYP321A1基因的转录主要被相同的反应元件和转录因子调节。测定了ARE/Nrf2通路的诱导剂二乙酯(DEM)和叔丁基对苯二酚(tBHQ)对CYP321A1基因启动子野生型和ARE-like元件缺失型报告基因重组载体活性的诱导作用,以及NADPH氧化酶抑制剂氯碘联苯(DPI)对黄酮、花椒毒素和二乙酯诱导的CYP321A1基因活性的抑制作用,并用荧光探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酯(DCFH-DA)测定了黄酮、花椒毒素和二乙酯处理后细胞活性氧(ROS)含量的变化,以及DPI预处理对细胞活性氧(ROS)含量的影响,结果表明:DEM和tBHQ显著地增强了野生型启动子活性,对ARE-like元件缺失型启动子活性基本没有诱导力,DPI处理对黄酮、花椒毒素和二乙酯的诱导活性有明显的抑制作用;黄酮、花椒毒素和二乙酯可诱导细胞ROS生成,DPI处理能削弱这种现象。Nrf2的同源蛋白——果蝇的CncC蛋白(dCncC)的异位表达和棉铃虫CncC(hCncC)的RNA干扰结果表明CncC蛋白对于黄酮、花椒毒素和二乙酯诱导的CYP321A1基因的转录是至关重要的。这些结果表明,ARE/CncC信号途径调节植物次生物质(黄酮、花椒毒素)诱导的美洲棉铃虫CYP321A1基因的表达。