背景及目的：膀胱过度活动症(overactive bladder, OAB)是指以尿急为主诉，伴有或不伴急迫性尿失禁，经常伴有尿频及夜尿增多的一类排尿功能障碍异常症候群。该病可独立发生，也可是多种泌尿外科疾病，如泌尿系感染、良性前列腺增生、老年性排尿异常、神经源性膀胱、下尿路梗阻、间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征、下尿路肿瘤、泌尿系结石、不明原因的男女性尿频等的伴发症状，如不及时终止病程，严重者还将引起肾、输尿管积水和肾功能损害。该病发病率随年龄的增长而增长，严重影响着患者的生活质量。膀胱逼尿肌兴奋性异常是此类疾病的共同发病机制和病程通路，研究和阐明其兴奋性调控及调控异常，明确该类疾病的发生机制，具有重大的基础、临床和社会意义。由于膀胱兼具自主神经/体神经的双重支配，因此膀胱储尿期兴奋性改变的发生机制较为复杂，尤其在兴奋功能异常的疾病中的作用及机制尚未完全阐明，其中神经源性/肌源性两大学说为最主要的理论。神经源性学说长期占据主导地位，它认为膀胱的兴奋调控，以及主要生理活动均来自于神经支配，神经在膀胱的生理及病理学机制中起决定性的支配作用，而临床治疗兴奋性异常也主要采用神经受体活性药物，如M受体的阻断剂等，但许多患者疗效不满意，同时离体的全膀胱或逼尿肌肌条存在自发性收缩这一现象，也高度提示除神经因素外，还存在着其它的调控因素。在此基础上，肌源性学说应运而生。该学说认为膀胱逼尿肌细胞自身有起搏和产生兴奋的作用，并倡导使用抑制细胞兴奋性药物用于临床治疗。这一理论的局限性则在于它无法解释膀胱收缩的“全或无现象”，且临床治疗依然有不尽满意之处。因此，探索膀胱源性兴奋性的完整机制，系统阐明其起源、调控，以及在膀胱兴奋性异常疾病中的改变，对于临床诊治有着极为重要的意义。膀胱源性兴奋性调控的一个重要环节就是发现及鉴定膀胱起搏系统的存在及其功能。在文献报道和我们的前期研究中，已经证实：①膀胱中存在起搏样细胞(Interstitialcells of Cajal，ICC)，ICCs对膀胱的自发性收缩活性有重要的起源作用。②膀胱ICCs具有起搏细胞的Ih内向特征电流，其生物学特性还受到整体、单细胞及分子水平的牵张负荷，以及多种受体的调节，功能上证实了ICCs作为起搏细胞的可能性。③逼尿肌的细胞间连接和信号传导的证实，提供了膀胱ICCs作为兴奋性调控枢纽的佐证。在兴奋性调控的离子通道中，钙离子通道有着举足轻重的地位。Ca2+是调节肌细胞兴奋和收缩的重要离子。钙通道按激活电压高低分为L型和T型，L型钙通道为高电压激活Ca2+通道，普遍存在于各种类型的细胞，主要参与肌细胞的收缩，而对兴奋性影响较小。在逼尿肌，其开放电压为-30/-25mv，最大开放电压为-10/0mv，因此主要形成细胞动作电位的超射。T型钙通道则主要参与调控细胞的兴奋性，具有以下特性：①低膜电位时激活；②失活快，通道关闭缓慢；③单通道的电导较低；④对阻滞剂Ni2+敏感；⑤Ca2+、Ba2+具有相对渗透性。由于T型Ca2+通道低膜电位激活特性，使其在动作电位的起始阶段发挥着重要作用。膀胱ICCs的成功鉴定和分离，提示其可能是兴奋起源和调控的中枢。T型钙通道被证实为膀胱兴奋性调控的主要通道。理论上讲，二者应存在着某种联系，据此，我们通过预实验证实了膀胱ICCs中存在T型钙通道，这为进一步研究其功能提供了可能。T型钙通道如何调控膀胱ICCs兴奋性，各亚型T通道在正常和DI膀胱ICCs中的表达有何差异，是否可以通过上调或阻断膀胱ICCs中的T型钙通道来改变膀胱ICCs兴奋性，以及调控T型钙通道后对膀胱ICCs功能的影响，尚缺乏深入研究。为了证实T型钙通道及亚型在大鼠膀胱ICCs上的表达及分布情况，并探索T型钙通道亚型在调控ICCs及膀胱兴奋性中的作用，本研究进行了初步探索。材料和方法：取200-240g大小的SD大鼠，通过制作大鼠膀胱出口梗阻（partial bladder outletobstruction，PBOO）模型，使其形成逼尿肌不稳定（detrusor instability, DI）。利用免疫荧光双标染色技术，分别染上ICCs特异性标志c-kit受体的抗体和T型钙通道各亚型(α1G, α1H, α1I)的抗体，观察ICCs的T型钙通道亚型的表达。同时，通过RT-PCR及Western blotting方法进一步检测T型钙通道各亚型在大鼠正常及DI膀胱的表达情况，观察正常及DI膀胱T型钙通道各亚型的表达变化。功能学方面，检测T型钙通道对ICCs自发性钙波及胞内钙离子的影响，使用金属离子荧光探针Fluo-3AM对培养的ICCs进行负载，在T型钙通道特异性阻滞剂（Mibefradil）和ICCs上c-kit受体阻滞剂（Glivec）作用下，观察钙波及胞内钙浓度([Ca2+]i)的变化情况。同时，进行了离体肌条牵拉实验，观察Mibefradil及Glivec对肌条自发性收缩的变化情况。最后，利用膜片钳技术检测急性酶分离的膀胱ICCs上的T型钙通道电流，并记录Mibefradil对T型钙电流的影响情况。结果：1. DI模型成功建立；免疫荧光双标染色显示T型钙通道各亚型(α1G, α1H, α1I)在膀胱ICCs上存在共表达，RT-PCR及WB检测进一步证实这一结果；DI时ICCs上α1G,α1H, α1I亚型表达量均增加，以α1G增加最明显。2.钙负载实验显示，T型钙通道阻滞剂Mibefradil可以明显降低ICCs的[Ca2+]i(p<0.01)。Glivec可进一步减低ICCs的[Ca2+]i(p<0.01)。而对平滑肌则只是Mibefradil可以明显降低SMCs的[Ca2+]i(p<0.01)，Glivec无效。3.肌条实验显示，CCH可增强肌条的自发性收缩，Mibefradil可明显降低肌条收缩幅度，Glivec进一步减低自发性收缩幅度，但对收缩频率均无明显影响。若先加入Glivec的肌条，Glivec明显抑制自发性收缩幅度，Mibefradil则不能进一步明显减低收缩幅度；频率均无明显变化。4.急性酶分离出大鼠膀胱ICCs；在ICCs上记录到典型的T型钙电流，DI时钙电流增强，且可被Mibefradil显著抑制。结论：1. T型钙通道α1G, α1H及α1I亚型在膀胱ICCs中均有表达，DI时各亚型表达量均增加，以α1G最为显著。2. T型钙通道参与调控ICCs的自发性兴奋性以及膀胱逼尿肌条收缩兴奋。3. T型钙通道特异性阻滞剂可抑制ICCs兴奋性，为治疗膀胱过度活动提供新疗法。