论文部分内容阅读
在疱疹病毒中,UL15蛋白作为末端酶亚基,是病毒DNA包装过程中的重要参与成员。鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）属于疱疹病毒亚科成员,研究显示,在感染DPV的细胞中,UL15蛋白最终定位于细胞核。但是在瞬时转染DPV UL15重组表达质粒pEGFP-N1-UL15或pcDNA3.1-UL15的细胞中,UL15蛋白只能定位于细胞质中。目前对于DPV UL15蛋白在病毒复制过程中如何进入细胞核这一问题尚未阐明。因此本文旨在对DPV UL15蛋白入核过程进行探索,以期初步阐明DPV UL15蛋白的入核机制,为研究DPV UL15蛋白的功能以及DPV基因组的包装过程奠定基础,并为靶向研制抗DPV新药提供理论依据。根据以上目标,本文开展的主要研究内容和获得的结果如下:1.DPV UL15蛋白入核辅助蛋白的鉴定本文构建了真核表达质粒pcDNA3.1-His-UL15以及潜在的UL15蛋白入核辅助蛋白UL6、UL28和UL33的重组质粒pCMV-C-Flag-UL6、pCMV-HA-UL28和pCMV-Myc-UL33。将以上重组质粒分别进行单独转染、双重转染以及三重共转至DF-1中,使用间接免疫荧光实验检测UL15蛋白的定位情况。结果显示,单独转染时UL15和UL28蛋白只能表达在细胞质中,UL6蛋白能完全定位于细胞核,UL33蛋白呈现核质均有现象。当UL15与UL28或者UL33蛋白共表达时,UL15蛋白仍不能进入细胞核,而UL15与UL6蛋白共表达时,UL15蛋白可以被部分携带入核。但是,当UL15与UL28和UL33进行三重转染时,UL15蛋白可以完全定位于细胞核。而UL15与UL6和UL28蛋白共表达或者UL15与UL6和UL33蛋白共表达时,UL15蛋白均未进入细胞核。根据以上结果发现,UL6蛋白可促进UL15蛋白部分入核,但是只有在UL28、UL33蛋白共同存在时,UL15蛋白才能够完全进入细胞核,说明UL15蛋白的入核是与UL28和UL33蛋白密切相关的。2.UL15蛋白NLS的鉴定本实验对UL15蛋白进行核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）分析,结果显示,UL15蛋白中不存在强烈的核定位信号,但是具有两个较弱的NLS:NLS1和NLS2。将NLS1和NLS2进行缺失和多点突变后,发现NLS1的缺失以及其中的K、R氨基酸的多点突变都对UL15蛋白定位产生了明显的影响。为了进一步确定NLS1和NLS2对UL15蛋白入核的影响,本实验通过构建真核表达质粒pcDNA3.1-His-UL151-345、pcDNA3.1-His-UL15346-740,分别包含了NLS1和NLS2。结果发现,UL151-345、UL15346-740分别与UL28和UL33共表达时,均不能定位于细胞核,说明UL15蛋白的入核除了需要NLS1,还需要UL15蛋白以其全长的形式存在。为了确认NLS1中对UL15蛋白入核起关键作用的氨基酸,将NLS1中K、R、P氨基酸分别进行单点突变为Q,结果表明K185、R188和P194位氨基酸的突变对UL15蛋白的定位没有产生明显影响,而K187或K190位氨基酸突变后UL15蛋白的定位受到了显著影响。为了进一步确定NLS1的功能,将NLS1分别与外源蛋白GFP、GFP-GFP和GFP-β-Gal进行融合表达,构建真核质粒pEGFP-C2-NLS1、pEGFP-GFP-C2-NLS1和pEGFP-C2-β-Gal-NLS1。结果显示,NLS1不具有改变GFP-β-Gal定位的能力,但是NLS1在一定程度上使GFP、GFP-GFP在细胞核中的荧光信号更强,说明NLS1具有较弱的NLS功能。