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背景近年来,我国心脑血管疾病发生增多,其病死率居于各类疾病之首,其中动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)占相当大比例。因此我国成立专项防治研究协作区,动脉粥样硬化成为医学研究的重点领域,并在其诊断、防治方面得到初步成果。在全基因组关联分析(Genome wide association study,GWAS)中发现Lipa——溶酶体酸性脂肪酶A(lysosomal acid type,Lipase A)与动脉粥样硬化形成有密切关联,但在动脉粥样硬化中泡沫细胞形成的影响方面未有阐述。目的群体遗传学研究发现Lipa与动脉粥样硬化发病相关,但其作用机制未明。本课题通过在RAW264.7巨噬细胞敲除、敲入Lipa基因并分析动脉粥样硬化关键病理过程的表型,探索Lipa基因在动脉粥样硬化发生发展过程中的对泡沫细胞形成的影响。方法通过文献分析,以动脉粥样硬化患者全基因组关联分析(GWAS)群体遗传研究结果为基础,筛选候选基因,分析组织表达特征确定Lipa基因为研究对象。下载打靶基因特定转录本序列于SnapGene软件进行标记,设计特异位点进行打靶。小鼠RAW264.7巨噬细胞在动脉粥样硬化机制研究、泡沫细胞形成研究中被广泛应用,且Lipa基因在巨噬细胞中高表达。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在RAW264.7巨噬细胞转染质粒在该细胞系中进行遗传修饰。设计检测引物,通过PCR手段检测在基因水平上对目标基因的敲除情况,挑选合适的基因修饰细胞的单克隆。利用流式细胞术,检测基因敲除RAW264.7细胞与野生型RAW264.7细胞关键清道夫受体CD36的表达。利用流式细胞术,检测基因敲除细胞株与野生型RAW264.7细胞对Dil红色荧光标记Ox-LDL摄入水平。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计对已获取单克隆基因敲除细胞进行基因再敲入,并且在敲入基因两端分别添加FLAG等蛋白标签。并且通过流式细胞术对基因敲入成功的细胞进行分选。使用蛋白质印迹法和免疫沉淀法检测基因敲入的蛋白。利用流式细胞术,检测Lipa基因敲除细胞、基因敲入RAW264.7细胞,及野生型对照RAW264.7细胞在动脉粥样硬化相关表型的差异。检测内容包括泡沫细胞形成关键清道夫受体CD36的表达,及巨噬细胞对Dil红色荧光标记Ox-LDL摄入水平。结果通过对AS-GWAS资料的总结,开展Lipa基因对动脉粥样硬化中泡沫细胞形成的研究,并且设计出其重要外显子序列靶位特异性敲除质粒。针对Lipa基因敲除,完成引物其设计、检测工作,使用PCR对Lipa基因敲除细胞进行检测,得到Lipa基因敲除单克隆细胞株若干。提取对应Lipa基因敲除单克隆细胞DNA,测序得到碱基序列。基因表达过程中3位密码子对应一个氨基酸蛋白,由于发现靶标之间外显子碱基数量减少数目均不为3的倍数,即密码子翻译蛋白质过程中出现移码突变情况,进一步分析由于单基因敲除克隆细胞株较正常基因序列提前出现终止密码子,导致译后氨基酸数量大大减少,会造成蛋白质翻译失败等结果。碱基序列和氨基酸序列水平差异都可验证该基因被成功敲除。利用流式细胞术,发现Lipa单基因敲除RAW264.7细胞在CD36上的表达与野生型RAW264.7细胞相比出现显著降低。利用流式细胞术,发现Lipa单基因敲除RAW264.7细胞对Dil红色荧光标记OxLDL摄入水平与野生型RAW264.7细胞相比也出现同样显著降低。成功对已获取单克隆Lipa单基因敲除细胞进行OST-Lipa-FLAG基因敲入。使用荧光显微镜以及流式细胞术确认敲入细胞群中存在大量BFP阳性细胞,成功得到BFP阳性细胞并且培养成功。使用蛋白印迹法,由于小鼠Lipa翻译后蛋白无特异性抗体,利用OST beads蛋白结合特异性和FLAG抗体进行验证,确认基因敲入在蛋白质水平成功。利用流式细胞术,检测单基因敲除后基因敲入RAW264.7细胞与野生型RAW264.7细胞在CD36上的表达,敲除再敲入细胞CD36表达水平已回补至野生型RAW264.7细胞表达水平。RAW264.7细胞可通过Ox-LDL诱导在体外形成巨噬泡沫细胞。利用多通道流式细胞术,检测比较单基因敲除后基因敲入RAW264.7细胞与野生型RAW264.7细胞对Dil红色荧光标记Ox-LDL摄入水平,敲除再敲入细胞摄取脂质能力已回补至野生型RAW264.7细胞摄取水平。结论Lipa基因缺失可显著减低巨噬细胞吸脂以及传递吸脂信号能力,影响泡沫细胞的形成,Lipa或为动脉粥样硬化中泡沫细胞形成研究的新靶位,并为动脉粥样硬化在诊疗、防治方面提供支持。