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鉴定影响早期肺发育的关键基因对于理解肺脏稳态平衡及肺再生医学治疗具有重要意义。ADAMTS（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs）是一类含I型血小板反应蛋白域的解整合素金属蛋白酶,在人类已发现19个家族成员,它们通过切割或修饰细胞外基质成分（Extracellular matrix,ECM）,在胚胎发育、组织形态发生、肿瘤等多种病生理过程中发挥重要作用。ADAMTS18是一种“孤儿ADAMTSs（orphan ADAMTSs）”,即不知功能或底物的ADAMTS家族成员。课题组长期致力于ADAMTS18生物学功能的研究,并成功构建了ADAMTS18基因敲除(Adamts18-/-)小鼠模型。在小鼠表型分析过程中,我们发现Adamts18-/-小鼠最为突出的改变是肺形态发育异常,Adamts18-/-小鼠肺脏边缘锐利,缺乏圆钝外形;病理学分析显示:大多数Adamts18-/-小鼠出生后肺部呈现出明显的肺泡扩张。通过原位杂交,我们发现Adamts18 mRNA主要表达于小鼠胚胎肺组织中。仅有的文献报道也显示ADAMTS18在人类胎肺中高表达。据此推测:ADAMTS18可能在早期肺发育过程中起关键作用。本研究利用实验室前期构建的Adamts18基因敲除小鼠,通过以下实验方法对ADAMTS18蛋白在肺发育中的作用进行了探讨。1)通过荧光定量聚合酶链式反应（Quantative real-time polymerasechain reaction,qRT-PCR）和RNA原位杂交技术（in situ hybridization,ISH）检测Adamts18 mRNA在小鼠肺组织中的时空分布特征;2)通过体外肺组织培养和气管铸型实验观察Adamts18-/-小鼠支气管发育各时期的形态;3)通过苏木素-伊红染色（hematoxylin and eosin,HE）染色、Hart’s染色、天狼星红染色、Masson染色、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）等方法对Adamts18+/+和Adamts18-/-小鼠的肺组织切片形态及蛋白的分布进行比较;4)通过小动物肺功能检测系统,检查Adamts18-/-小鼠的吸气时间、呼气时间、呼吸频率、最高气道压力、平均气道压力、潮气量、每分钟通气量和最高吸气/呼气流速的变化;5)腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导急性肺损伤模型,气管滴注博来霉素诱导肺纤维化模型,制作石蜡切片后通过病理评分,评估小鼠在疾病模型中的肺损伤修复情况;6)通过非标记蛋白质组学,比较E14.5天Adamts18+/+和Adamts18-/-小鼠胎肺的差异蛋白,并利用metascape平台对差异蛋白进行基因功能（Geneontology,GO）和信号通路富集分析;7)通过蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）、透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）、qRT-PCR技术对组学筛选出的蛋白进行验证;8)通过体外蛋白表达、细胞免疫荧光、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）、酶联免疫吸附（Elisa）等方法验证ADAMTS18与靶蛋白的相互作用。实验结果:1)Adamts18 mRNA主要表达于肺发育的胚胎期（Embryonic,E9.5-E12.5）和假腺管期（E12.5-E16.5）,由气道远端上皮表达,胚胎期双侧肺尖的基质细胞中也可见Adamts18 mRNA的表达;到囊泡期（E17.5-P5）其在远端上皮的表达量明显降低,肺泡发育期（Postnatal,P5-P21）及成年后几乎检测不到Adamts18的表达。2)经解剖形态学比较,Adamts18-/-小鼠在E14.5天和12周龄时,双侧肺尖部位尖锐,明显区别于Adamts18+/+鼠肺的圆钝外观。3)E11.5的胎肺经体外培养后,与Adamts18+/+小鼠相比,Adamts18-/-小鼠肺支气管数目显著减少(Adamts18+/+vs.Adamts18-/-:48h,35.50±0.50 vs.25.00±2.08,P<0.05*;72h,56.50±2.50 vs.41.00±1.16,P<0.05*),支气管长度变短;成年后的Adamts18-/-小鼠支气管数目也比正常小鼠少。4)肺泡发育成熟后,Adamts18-/-小鼠的肺泡腔扩张,放射状肺泡数减少,弹性纤维在肺泡壁上大量沉积,而肺功能的压力、容积和流速各项指标均正常。5)在急性肺损伤模型中,Adamts18-/-小鼠损伤更严重,表现出更多的肺泡隔、肺泡腔充血;在肺纤维化模型中,与Adamts18+/+小鼠相比,Adamts18-/-小鼠的生存率显著降低,肺组织结构破坏更严重,并在组织切片上表现出大面积的胶原沉积及炎性细胞浸润;而在成年时期已经几乎不表达的Adamts18 mRNA在这两种损伤模型中也未见表达。6)与气道分支相关的主要分子包括Fgf10,Wnt2,Bmp4,Hhip,Ptch1和Ext1的表达在Adamts18-/-小鼠胎肺组织中未见显著改变,而Fgfr2,Shh的转录水平在Adamts18-/-小鼠中显著升高。7)蛋白质组学结果显示,在E14.5天的Adamts18-/-小鼠肺组织中,构成微纤维（microfibrils）的原纤蛋白1和2（fibrillin1,2）在Adamts18-/-小鼠中的表达水平均显著升高,多个与细胞骨架组装相关的蛋白也发生了显著改变;TEM结果显示Adamts18-/-小鼠上皮和间质之间可见microfibrils沉积。8)细胞免疫荧光结果证明ADAMTS18蛋白与fibrillin1蛋白共定位,Co-IP实验结果表明fibrillin1可以与ADAMTS18共沉淀,Elisa结果显示重组ADAMTS18-C901-1187片段与fibrillin1的N端结合力较强。9)在体外肺培养体系中,通过添加400 ng/ml的抗fibrillin1抗体减少fibrillin1的量,可以挽救在Adamts18-/-小鼠支气管发育不良的表型;10)信号通路研究发现,Adamts18-/-小鼠肺上皮细胞的局部粘着斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）磷酸化信号减弱,纤维型肌动蛋白（Filamentous actin,F-actin）细胞骨架组装异常,细胞迁移实验说明Adamts18缺失的小鼠胚胎成纤维细胞迁移能力降低。综上所述,ADAMTS18由气道上皮细胞分泌,通过作用于fibrillin1,影响microfibrils在细胞外基质的分布,ADAMTS18缺失导致fibrillin1和fibrillin2表达量升高,microfibrils在气道的上皮和间质之间异常沉积,抑制了上皮内FAK的磷酸化,导致细胞骨架无法正常组装,从而影响上皮细胞的迁移,最终导致支气管分支异常。本研究首次证实ADAMTS18蛋白可通过影响原纤蛋白代谢来调控早期肺脏支气管发育,这不仅有助于拓展肺脏发育的新机制,也有可能为早期肺发育异常相关性疾病的临床诊断治疗提供新视角和新的分子靶点。