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肺癌(Lung Cancer,LC)的发病率和死亡率位居全球肿瘤首位,是一种严重危害人类身体健康的疾病。根据病理类型将肺癌分为小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC),分别占肺癌总数的20%和80%。非小细胞肺癌患者早期可进行手术治疗,中晚期患者多采用手术、化疗、放疗等手段联合治疗,不仅患者痛苦、易出现耐药性,且总体治愈率仍小于20%。因此,急需探讨和寻找新型治疗方法。旋毛形线虫(Trichinella spiralis,T.s)又称旋毛虫,可以引起人和动物的旋毛虫病,近年来研究发现,旋毛虫寄生能够抑制肿瘤生长,动物体内和体外实验均证实了旋毛虫的活性蛋白能够抑制肿瘤细胞的增殖。课题组前期研究表明旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白(Excertory-secretory proteins,ESPs)能够有效抑制肿瘤细胞增殖。转录组(Transcriptome)是某物种或者特定细胞类型产生的全部转录本的集合。能够从整体水平上研究基因功能以及结构,揭示特定生物学和疾病发生过程中的分子机制,已广泛应用于临床诊断、基础研究与药物研发等领域。目前尚未有文献报道关于旋毛虫肌幼虫ESPs作用于A549细胞后的基因表达水平和信号通路的相关研究,本研究内容之一是以A549细胞作为研究对象,通过转录组测序技术(RNA-sequencing,RNA-seq),探究旋毛虫肌幼虫ESPs对人非小细胞肺癌A549细胞基因表达和信号通路的影响,为抗肿瘤药物的研发提供实验依据。另外课题组前期运用质谱法筛选出旋毛虫肌幼虫ESPs中的六种抗肿瘤成分,本实验筛选了其中一种即剪切聚腺苷酸化特异因子亚基2(Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor subunit 2,CPSF2),构建了CPSF2重组蛋白及真核表达质粒,观察了CPSF2重组蛋白及质粒是否具有诱导A549细胞凋亡的作用以及作用的可能分子机制。第一部分旋毛虫肌幼虫ESPs作用于A549细胞转录组学研究目的:通过转录组测序技术探究旋毛虫肌幼虫ESPs作用于A549细胞后基因表达水平和信号通路变化情况。方法:1构建文库:按照NEB Next Poly(A)m RNA Magnetic Isolation Module试剂盒说明书对各组样本进行m RNA富集。使用KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit(Illumina)处理产物RNA后构建文库。2测序:使用Illumina Nova Seq 6000测序仪测序。3对实验组和对照组6个样本的转录组测序数据进行转录表达定量分析、差异表达基因筛选、GO功能显著性富集分析、Pathway通路分析。结果:1对照组3个样本和实验组3个样本分别得到31475828、28699647、33661971、33000876、25627123、27549020个Read Pairs。2经过差异分析后得到2860个差异表达基因,其中含有上调基因为1634个,下调基因为1226个。3在上调的表达基因中,富集基因最多的三个条目分别是生物过程分类中的发展过程条目、分子功能分类中的蛋白结合条目和细胞组分分类中的细胞条目。在下调基因中,富集基因最多的三个条目分别是生物过程分类中的代谢过程条目、分子功能分类中的酰胺结合条目和细胞组分分类中的胞内条目。4 2860个差异表达基因共参与了74个信号通路,其中71个信号通路被显著富集(P<0.05)。上调基因富集差异最多的通路为癌症通路,下调基因富集差异最多的通路为代谢途径。结论:1旋毛虫ESPs对A549细胞基因表达和信号通路均有影响,经过差异分析后得到2860个差异表达基因,其中上调基因为1634条,下调基因为1226条。2差异表达基因涵盖细胞组分、分子功能、生物过程三个方面。并主要富集在71个信号通路中。第二部分CPSF2真核表达质粒的构建及对A549细胞凋亡和周期的影响目的:通过构建CPSF2原核表达和真核表达载体,研究重组蛋白和真核表达质粒对非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,探讨CPSF2重组蛋白和真核表达质粒诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的可能机制。方法:1 Annexin V-FITC/PI双染法检测A549细胞凋亡率:实验组将2μg、4μg的质粒分别转染A549细胞后培养24h,空质粒组加入100μL无血清培养基和10μL转染试剂,转染A549细胞后培养24h,阴性对照组不做任何处理,收集细胞后用PI染色液和FITC染色液染色,通过流式细胞仪检测A549细胞凋亡情况。2 PI染色法检测A549细胞周期阻滞:实验组将2μg、4μg的质粒分别转染A549细胞后培养24h,空质粒组加入100μL无血清培养基和10μL转染试剂,转染A549细胞后培养24h,阴性对照组不做任何处理,收集细胞后用PI染色液染色,通过流式细胞仪检测A549细胞周期阻滞情况。3 Real-time PCR方法检测A549细胞凋亡相关因子的m RNA转录水平:实验组将2μg、4μg的质粒分别转染A549细胞后培养24h,空质粒组加入100μL无血清培养基和10μL转染试剂,转染A549细胞共后培养24h,提取核酸检测Bip、Atf4、Chop、Perk、Elf2α、Bax、Caspase-3、Caspase-9基因的转录水平。4统计学分析:使用SPSS19.0统计学软件对数据进行分析。采用单因素方差分析处理数据。P<0.05代表差异具有统计学意义。结果:1 Annexin V-FITC/PI双染法检测A549细胞凋亡率:对照组、空质粒组、低浓度质粒转染组、高浓度质粒转染组的总凋亡率分别为35.89%、34.15%、38.76%、49.8%,和空质粒组总凋亡率相比,低浓度质粒转染组、高浓度质粒转染组的总凋亡率高于空质粒组并呈逐渐递增的趋势,且以晚期凋亡为主,差异具有统计学意义(P<0.05)。对照组、空质粒组、低浓度质粒转染组、高浓度质粒转染组的晚期凋亡率分别为29.46%、29.46%、34.15%和43.81%,和空质粒组晚期凋亡率相比,低浓度质粒转染组、高浓度质粒转染组的晚期凋亡率高于空质粒组并呈逐渐递增的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 PI染色法检测A549细胞周期阻滞:G0/G1期细胞所占比例:对照组为(49.6±0.87)%;空质粒组为(48.64±0.13)%;低浓度质粒转染组为(42.0±0.35);高浓度质粒转染组为(53.34±1.02)%。和空质粒组相比,高浓度质粒转染组G0/G1期细胞所占比例增高(P<0.05)表明高浓度质粒转染组细胞阻滞在G0/G1期。S期所占细胞比例:对照组为(35.2±6.5)%;空质粒组为(41.88±0.82)%,低浓度质粒转染组为(48.70±2.79)%;高浓度质粒转染组为(36.11±6.48)%。和空质粒组相比,低浓度质粒转染组S期所占比例增高(P<0.05),表明低浓度质粒转染组细胞阻滞在S期。3 Real-time PCR方法检测A549细胞凋亡相关因子的m RNA转录水平:Real-time PCR结果显示,与空质粒组对比,低浓度质粒转染组的Bip、Perk、Elf2α的m RNA转录水平呈上调趋势(P<0.05),差异具有统计学意义。与空质粒组对比,高浓度质粒转染组的Bip、Perk、Elf2α的m RNA转录水平无明显变化(P>0.05)。与空白对照组相比,低浓度质粒转染组和高浓度质粒转染组的Chop、Atf4的m RNA转录水平均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比,低浓度质粒转染组及高浓度质粒转染组的Caspase-3、Caspase-9、Bax的m RNA转录水平均无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1 CPSF2真核表达质粒转染于人非小细胞肺癌A549细胞株,可以诱导A549细胞发生凋亡,以晚期凋亡为主。可能是通过上调Bip、Perk、Elf2α而发挥作用。2 CPSF2真核表达质粒转染于人非小细胞肺癌A549细胞株,低浓度质粒转染组和高浓度质粒转染组分别阻滞A549细胞于S期和G0/G1期。