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2019年12月,由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引发的人类新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease2019,COVID-19)疫情暴发,并迅速波及全球,严重危害了人类身体健康和全球经济发展。随着疫情的不断反复,抗疫形势严峻。本课题旨在对前期通过杂交瘤技术筛选获得的抗SARS-CoV-2鼠源单抗20D8进行人源化改造,并对改造后的抗体进行功能鉴定,以期为SARS-CoV-2治疗性抗体药物的研发奠定一定基础。本课题首先提取杂交瘤细胞20D8总RNA,反转录成c DNA后,设计特异性引物,钓取鼠源单抗重/轻链可变区序列;然后将鼠源单抗重/轻链可变区序列和人单抗Ig G1/κ的恒定区序列进行拼接,分别加上相应的信号肽和酶切位点等,合成至KS001表达载体,构建重组质粒后,瞬转Expi293F细胞表达嵌合单抗ch20D8;再对ch20D8抗体进行体外功能鉴定,并进一步在K18-h ACE2转基因小鼠体内进行药效学评价。结果显示,嵌合改造后的ch20D8亲和力几乎未下降,ch20D8对原型株受体结合域(receptor binding domain,RBD)结合活性半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)为2.848 ng/m L,阻断原型株RBD与血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)为156.8 ng/m L,对原型株假病毒中和活性IC50为1.504 ng/m L,对其他变异株也具有较强的结合活性、阻断活性和中和活性;小鼠体内药效学评价结果表明,ch20D8对感染B.1.617.2变异株活病毒的K18-h ACE2小鼠具有较好的保护效果。以上结果证明了钓取的鼠源单抗可变区序列的正确性,且鼠源抗体嵌合改造成功。为进一步降低抗体鼠源成分,采用互补决定区(complementarity determining region,CDR)移植技术及回复突变技术对鼠源单抗20D8进行人源化改造,并对改造后的抗体进行功能鉴定。首先,构建人源化组合突变Fab文库,并对文库进行筛选,得到具有高亲和力且回复突变位点少的Fab克隆;然后,将筛选到的Fab克隆插入到已含抗体恒定区(Ig G1/κ)序列的pc DNA3.4载体中,构建完整的重/轻链重组质粒后,瞬转Expi293F细胞表达人源化单抗h20D8;再对h20D8进行一系列的鉴定,包括理化及生物学活性的鉴定。理化鉴定结果显示,h20D8重/轻链大小与理论分子量基本一致,纯度较高,等电点(isoelectric point,p I)为7.928~8.716。生物学活性鉴定结果显示,h20D8对原型株RBD结合活性EC50为3.641 ng/m L,阻断原型株RBD和ACE2结合的IC50为227.6 ng/m L,对原型株假病毒和活病毒中和活性IC50分别为2.874 ng/m L和14.46 ng/m L,对其他变异株也具有较强的结合活性、阻断活性和中和活性。与ch20D8相比,h20D8结合活性、阻断活性和中和活性几乎未下降,人源化改造成功。综上,本课题钓取了鼠源单抗20D8可变区序列,并成功对其进行了人源化改造,改造后的h20D8单抗亲和力及生物学活性几乎未下降,对原型株、B.1.1.7、B.1.351、P.1和B.1.617.2变异株均具有强中和活性,这为后续开发广谱、高效的SARS-CoV-2治疗性抗体药物奠定了基础。