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肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种常见的消化道功能障碍,患者易出现肠粘膜低度炎症,但其发生机制尚不明确。1最近的研究显示腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant IBS,IBS-D)患者体液免疫异常亢进。23IgA是体液免疫重要组成部分,构成粘膜表面的第一道免疫屏障,4不仅能防御病原体感染,还能保护粘膜免受共生微生物的渗透。5肠道菌群中的细菌刺激肠道粘膜产生IgA,同时自身也可被IgA所覆盖,转化为IgA包被的形式。6肠道微生物群和粘膜体液免疫系统之间的平衡状态是健康肠道的特征。已有研究表明炎症性肠病(inflammatory boweldisease,IBD)患者粪便标本中IgA水平异常升高,且IgA包被细菌(IgA+细菌)在IBD发病过程中起着重要的作用。7-11然而在腹泻型肠易激综合征中,IgA和IgA包被的细菌是否发生改变并参与调节IBS-D的发病,目前尚无相关研究。本研究将通过检测受试者体内IgA含量、IgA包被细菌数量以及肠道微生态结构,分析其与IBS-D临床表现的相关性,探究这些改变对IBS-D的发病的影响。第一部分肠道IgA与腹泻型肠易激综合征目的:1.检测受试者血浆及粪便中IgA含量、肠粘膜组织中IgA 阳性细胞数量、血细胞及肠粘膜组织中IgA相关基因的表达情况。2.统计分析肠道IgA与腹泻型肠易激综合征临床特征的相关性。材料与方法:1.选取2018年至2019年间于山东大学齐鲁医院消化内科就诊的44名IBS-D患者及32名健康志愿者作为研究对象纳入本研究。其中IBS-D患者的诊断符合罗马IV标准。2.采用ELISA检测受试者血浆中IgA的含量。对受试者血细胞中AID、IGHA1、IGHA2、TGF-β1、BAFF-R、BCMA和TACI基因的表达进行实时定量PCR检测。3.在受试者接受肠镜检查的肠道准备之前,留取粪便标本,ELISA法检测粪便IgA的含量。4.对受试者进行肠镜检查,获取回肠末端及盲肠活检组织,对肠粘膜组织进行免疫荧光染色,检测IgA阳性细胞。实时定量PCR检测肠粘膜组织中AID、IGHA1、IGHA2、TGF-β1、BAFF-R、BCMA 和 TACI 基因的表达水平。结果:1.ELISA检测结果表明IBS-D患者组粪便IgA含量显著高于健康对照组(p=0.0115),而血浆中IgA水平在两组之间的无明显差别。2.组织免疫荧光检测提示,IBS-D患者回肠末端的IgA阳性细胞数量与健康对照组相比有增高趋势(p=0.0641),而两组之间盲肠粘膜的IgA阳性细胞数量未见显著差异。3.IBS-D患者回肠末端IGHA1的表达水平较健康对照组明显提高(p<0.0001),而IGHA2的表达量两组之间无明显差异(p=0.1401)。此外,未发现血液和盲肠粘膜上存在IGHA1及IGHA2表达的组间差异。4.通过实时定量PCR发现,在回肠远端粘膜,IBS-D组AID的mRNA表达明显高于健康组(p=0.0005),但两组之间的血液(p=0.3245)和盲肠粘膜(p=0.8682)未见显著表达差异。IBS-D患者回肠远端粘膜BAFF-R的mRNA表达明显上调(p=0.0003)。而 TACI 的 mRNA 表达呈上升趋势(p=0.0769),BCMA 和 TGF-β1的mRNA表达在两组之间没有统计学差异。此外,在盲肠粘膜和血液样本中,两组之间BAFF-R、TACI、BCMA及TGF-β1的mRNA表达均无差异。5.排便频率、粪便性状、腹部疼痛的强度和频率及肠易激综合征严重程度评分(IBS-SSS)与粪便IgA含量及回肠末端AID和IGHA1基因的mRNA表达呈正相关。结论:与健康对照组相比,IBS-D患者肠道IgA显著增加,主要体现在IgA1亚型在回肠末端表达量的增加。此外,患者回肠末端IgA抗体类别转换(class switch recombination,CSR)调节基因的活性增强,表明回肠末端IgA抗体类别转换增强。而粪便IgA及回肠末端AID和IGHA1基因的mRNA表达量与受试者的排便频率、粪便性状、腹部疼痛的强度和频率及IBS-SSS等临床指标呈正相关。本研究证实肠道IgA与腹泻型肠易激综合征密切相关,为进一步探索腹泻型肠易激综合征的发病机制及诊疗方案提供了理论基础。第二部分腹泻型肠易激综合征中IgA包被细菌的变化目的:1.检测受试者粪便中IgA+细菌的比例。2.统计分析IgA包被细菌与腹泻型肠易激综合征临床特征的相关性。材料与方法:1.在受试者肠镜检查做肠道准备前,留取粪便标本。2.采用Mpbio Fastprep Lysing MatrixD管用于粪便匀浆,并采用藻红蛋白标记的抗人IgA抗体(anti-IgA-PE抗体)染色后进行流式细胞分析,得到粪便细菌中IgA包被细菌的比例。结果:1.与健康对照组相比,患者粪便中IgA+细菌的比例显著升高(p=0.0024)。2.粪便IgA包被细菌的比例与排便频率、粪便性状、腹部疼痛的强度和频率及IBS-SSS正相关。结论:本研究提示IgA包被的肠道菌群与腹泻型肠易激综合征密切相关,IBS-D患者粪便中IgA+细菌的比例较健康对照组显著升高,且与排便频率、粪便性状、腹部疼痛的强度和频率及IBS-SSS正相关。第三部分IgA相关菌群在腹泻型肠易激综合征中的作用目的:1.分选粪便中IgA+细菌和IgA-细菌。2.测序分析粪便总细菌、IgA+细菌和IgA-细菌的菌群组成。材料与方法:1.留取受试者肠道准备前的粪便标本。2.采用Anti-PE MicroBeads和QuadroMACS启动包对抗人IgA-PE抗体染色后的粪便样本进行细菌的分选。经过磁激活细胞分选术分选后,粪便细菌被分为IgA阴性部分和IgA阳性部分。3.16S rRNA基因测序分析IgA阴性细菌和IgA 阳性细菌。结果:1.IBS-D患者肠道有1 7个细菌种属与健康对照组显著差异。2.IBS-D患者的IgA+菌群与IgA-菌群构成不同。与IgA-细菌相比,IgA+细菌中Escherichia-Shigella、Romboutsia、Streptococcus、Tyzzerella-4、Klebsiella、Intestinibacter、Granulicatella和Haemophilus的相对丰度更高。3.17种病例组与健康对照组不同的细菌与IgA高包被细菌存在交集,交集中包括 Escherichia-Shigella、Granulicatella 和 Haemophilus3 个属。4.Escherichia-Shigella的相对丰度与排便频率、粪便性状、腹痛强度和频率及IBS-SSS呈正相关。而Escherichia-Shigella ICI评分则分别与焦虑评分和抑郁评分呈正相关。结论:与健康对照组相比,IBS-D患者肠道菌群组成发生改变。且IBS-D患者的IgA+菌群与IgA-菌群不同。二者存在交集,包括Escherichia-Shigella、Granulicatella 和Haemophilus 3个属。其中,Escherichia-Shigella 与排便频率、粪便性状、腹痛程度和频率、IBS-SSS及焦虑和抑郁程度正相关。表明肠道菌群可能通过诱导机体局部免疫系统IgA的生成,从而与腹泻型肠易激综合征密切相关,而Escherichia-Shigella在其中扮演了不可忽视的重要作用。