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持续大量蛋白尿是多种肾小球疾病最主要的临床表现,它不仅与肾小球硬化关系密切,还可以引起肾小管间质炎症反应和纤维化,因此是慢性肾病进展的独立危险因素。白蛋白是肾小球疾病蛋白尿中的主要成分。研究表明,白蛋白超负荷重吸收可激活肾小管上皮细胞产生大量炎性介质、细胞因子、生长因子以及细胞外基质蛋白等;还可介导小管上皮细胞凋亡和转分化,导致肾间质纤维化发生。此外,尿蛋白诱导活化的肾小管上皮细胞还可以通过旁分泌途径激活或损伤肾间质中的其它细胞成分例如成纤维细胞,进而协同促进肾间质纤维化的发生。管周微血管是肾间质的重要结构组份,与肾小管上皮细胞毗邻,在维持肾脏正常生理功能方面具有举足轻重的作用。管周微血管内皮细胞损伤可直接导致肾间质缺血缺氧,因此被认为是慢性肾病进程中肾间质纤维化的重要病理生理基础,然而管周微血管内皮损伤与尿蛋白诱导活化的肾小管上皮细胞之间的关系以及机制尚不清楚。我们前期研究发现,在肾病综合征患者肾间质尚未出现明显纤维化时,管周微血管内皮细胞的增殖活性即明显降低,管周微血管密度显著减少,后者分别与肾小管上皮细胞胞浆内吞饮的白蛋白量及其吞饮受体cubilin的表达呈显著负相关关系。那么肾小管上皮细胞超负荷重吸收白蛋白可能与慢性肾病肾间质微血管损伤之间存在某种内在关系?Cubilin是否在其中扮演了重要角色?已有研究表明,肾小管上皮细胞超负荷重吸收白蛋白后可产生大量活性氧簇（ROS）,而ROS可通过增加血管内皮细胞的通透性、炎细胞浸润、影响细胞的增殖活性、导致内皮细胞死亡和凋亡,在血管性疾病的病理过程中起着非常重要的作用,但目前尚不清楚白蛋白诱导活化的肾小管上皮细胞产生大量ROS是否是肾病状态下管周微血管损伤的重要原因之一。为此,本研究观察了白蛋白对体外培养的HKC细胞cubilin表达的影响以及白蛋白激活HKC产生ROS的变化规律。通过细胞共培养的方法研究经白蛋白激活的肾小管皮细胞（HKC）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖与凋亡的影响。以cubilin siRNA抑制白蛋白吞饮,观察HKC产生ROS的变化及其对HUVEC凋亡以及形成管样结构的影响;进一步以线粒体电子传递链复合物I抑制剂鱼藤酮抑制HKC产生ROS,观察其对HUVEC损伤的保护效应。总体思路如下:一、实验方法1、针对人cubilin基因设计并构建siRNA真核表达载体pSUPER EGFP-C1、C2,转染肾小管上皮细胞（HKC）,经荧光定量RT-PCR检测不同浓度的人血清白蛋白（HSA）刺激HKC细胞cubilin mRNA的表达变化及两个重组质粒对HKC cubilin基因mRNA的抑制作用。2、Cubilin siRNA表达质粒对HKC吞饮白蛋白的抑制作用通过激光共聚焦显微镜检测HKC吞饮罗丹明标记牛血清白蛋白（TRITC-BSA）的量效及时效关系并检测重组质粒对该效应的抑制作用,筛选抑制效率较高的一个重组质粒继续下一步实验。3、Cubilin siRNA表达质粒对HKC超负荷吞饮白蛋白超后引起ROS变化的干预作用采用荧光探针法和化学比色法对白蛋白超负荷重吸收后HKC的超氧阴离子(O2·-)和培养细胞上清中过氧化氢（H2O2）进行测定,观察其量效及时效关系,并观察cubilin siRNA表达载体及抗氧化剂鱼藤酮对其抑制作用。4、白蛋白超负荷损伤肾小管上皮细胞对血管内皮细胞的影响观察经白蛋白活化的HKC对HUVEC管样结构形成及增殖与凋亡影响;以白蛋白刺激经cubilin siRNA表达载体及抗氧化剂鱼藤酮预处理的HKC,观察后者对HUVEC增殖与凋亡的影响。二、实验结果1、酶切及测序结果证明,两对插入的64bp序列与设计的cubilin siRNA序列一致,表明本实验成功构建了cubilin siRNA表达载体pSUPER EGFP-C1、C2。荧光定量PCR结果显示:HSA刺激HKC后cubilin mRNA表达呈剂量依赖性上调;与正常组相比较,pSUPER EGFP-C1、C2转染组的cublin mRNA表达明显降低（P<0.01）,两组的抑制效率分别为66%、37%,而pSUPER EGFP转染组cubilin表达无明显差异（P>0.05）。2、HKC吞饮白蛋白呈剂量及时间依赖性上调,与正常组相比较,转染了pSUPER EGFP-C1、C2的HKC吞饮白蛋白明显减少（P<0.01）,且pSUPER EGFP-C1更为明显,而转染pSUPER EGFP的HKC吞饮白蛋白较对照组无明显差异（P>0.05）。3、高浓度HSA刺激HKC后细胞内O2·-及上清中H2O2产生明显增加,且与白蛋白浓度具有显著的剂量及时间依赖性关系,cubilin siRNA表达载体和鱼藤酮可明显抑制细胞内O2·-及上清中H2O2产生（P<0.05）。4、与对照组比较,高浓度HSA活化的HKC可使培养的内皮细胞管样结构形成减少,内皮细胞凋亡增加（P<0.05）;与HSA刺激组比较,cubilin siRNA表达载体及鱼藤酮预处理的HKC经白蛋白刺激后与HUEVC共培养,内皮细胞管样结构形成增加且细胞凋亡减少（P<0.05）。三、结论1、HKC超负荷吞饮白蛋白伴随cubilin mRNA表达上调以及细胞内ROS的产生,后者与共培养体系中的内皮细胞凋亡以及血管管样结构形成受抑制关系密切;cubilin siRNA可抑制HKC cubilin基因的表达及其对白蛋白的吞饮,减少细胞内ROS的产生,对共培养体系中的内皮细胞具有保护效应。提示cubilin介导了肾病状态下肾小管上皮细胞对白蛋白的超负荷重吸收,后者可能在慢性肾病管周微血管病变中具有重要作用。2、超负荷吞饮白蛋白可激活HKC线粒体电子传递链产生大量ROS,后者与肾病状态下管周微血管内皮损伤有关。鱼藤酮可抑制大量白蛋白诱导HKC产生ROS,对管周微血管内皮细胞具有保护效应。