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池蝶蚌性腺发育过程中大部分时间是单性个体,少部分个体在26-34月龄出现雌雄同体现象,而影响其性腺发育和雌雄同体现象的因素一直未知。本研究连续两年对池蝶蚌性腺进行雌雄同体现象筛选及跟踪观察,并采用五个温度诱导池蝶蚌生殖滤泡分化,通过对不同时期的池蝶蚌的性腺进行qRT-PCR检测,同时利用原位杂交技术和Western blot对性别决定关键基因Dmrt1进行细胞定位和蛋白定量,探究温度对池蝶蚌性腺发育的影响。1、自然养殖条件下池蝶蚌性别分化规律调查自然条件下,6月龄池蝶蚌中也出现了雌性滤泡为主的雌雄同体现象,并且28、29月龄筛选的雌雄同体蚌生长到30月龄左右出现了不同方向的性别分化:77.8%转变为雄蚌、16.7%维持雌雄同体现象至38月龄、5.5%转变为雌蚌;检测生长到31月龄的雌雄同体蚌性腺,发现其存在三种类型的生殖滤泡:雌性滤泡、雄性滤泡、雌雄生殖细胞共存滤泡,且随着发育的进行,同一批雌雄同体蚌发育处在不同的状态:一些雌雄同体蚌中雄性生殖滤泡占99%,基本无空腔;一些雌雄生殖滤泡各占50%,空腔小或者无;一些雌雄生殖滤泡各占50%,但空腔很大。2、池蝶蚌性别决定相关基因Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9、Dmrt1、Foxl2在性腺组织中的mRNA时空表达对池蝶蚌胚胎、1-7月龄内脏团、27-32月龄雌和雄蚌、29和31月龄雌雄同体蚌性腺中性别相关基因的时空表达分析。结果显示:Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9四个基因在1-7月龄的mRNA表达水平与胚胎期相比除5月龄外没有明显变化,Fem1b和Fem1c的mRNA水平有相同的变化趋势,与Tra2a大体一致,Sox9除在5月龄外与Fem1b和Fem1c表达水平有相同的变化趋势;Dmrt1基因在1-7月龄的mRNA水平与胚胎期相比,1-5月龄基本不表达,6、7月龄的表达量有显著性上升。Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9四个基因在27-32月龄的雌蚌和雄蚌性腺组织中均有表达,且27-30月龄Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9四个基因在雌蚌和雄蚌性腺组织中的表达趋势一致;31-32月龄时,Tra2a、Fem1b、Fem1c的表达趋势一致,Sox9的表达趋势与之相反。比较雌蚌和雄蚌性腺组织的表达量,发现Tra2a和Sox9在雄蚌中的mRNA表达高于雌蚌;Dmrt1在27月龄雄蚌中表达高于雌蚌,在28-32月龄的雄蚌性腺组织中特异性表达。Tra2a、Fem1b、Dmrt1三个基因在29和31月龄雌雄同体蚌的表达量先上升,后下降,并且与Sox9在31月龄的表达量呈现相反的趋势。Foxl2在雌蚌、雌雄同体蚌中的表达显著高于雄蚌。结果表明,雌雄同体或性逆转蚌的产生可能需要Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9、Dmrt1、Foxl2六个基因的参与,其中涉及的性别调控通路可能有多条。3、温度对池蝶蚌生殖滤泡分化及性别调控相关基因mRNA表达的影响在15℃、19℃、23℃、27℃、32℃温度刺激下,对13月龄和26月龄池蝶蚌分别进行为期1个月的养殖实验,实验结束时石蜡切片检测池蝶蚌的性别和qRT-PCR检测性别决定相关基因Tra2a、Fem1b、Sox9、Dmrt1、Foxl2在性腺中的mRNA的表达。切片结果显示:14月龄组池蝶蚌在32℃条件下,12.5%的雄蚌转变为雌雄同体;27℃条件下,37.5%的雄蚌发生性逆转,23℃条件下,14.29%的雌蚌发生性逆转;19℃条件下,25%的雌蚌发生性逆转。27月龄组27℃条件下,有12.5%的雄蚌发生性逆转。qRT-PCR结果显示:14月龄雌蚌中,Tra2a、Fem1b、Sox9三个基因在五个温度的表达趋势相似,且表达无明显变化;Dmrt1在19℃和23℃的表达显著高于其他温度;Foxl2在19℃和23℃的表达显著低于其他温度。14月龄雄蚌组中,Tra2a、Fem1b、Sox9三个基因在五个温度的表达趋势相似,在19℃、23℃、27℃的表达显著高于其他温度。Dmrt1在19℃、23℃、27℃和32℃下的表达无明显变化,但显著高于15℃;Foxl2在27℃的表达高于其他温度。27月龄雌蚌组中,Tra2a、Fem1b、Sox9三个基因在五个温度的表达趋势相似,且表达无明显变化;Dmrt1在19℃的表达显著高于其他温度;Foxl2在27℃表达显著高于19℃、23℃和32℃。27月龄雄蚌组中,Tra2a、Fem1b在五个温度的表达趋势相似,且表达无明显变化;Sox9在23℃的表达显著高于其他温度;Dmrt1在32℃的表达显著高于其他温度;Foxl2在五个温度下基本上不表达。结果表明,温度影响池蝶蚌生殖滤泡的分化,27℃及以上的高温容易诱导雄蚌向雌蚌逆转或产生雌雄同体现象,23℃及以下的低温容易诱导雌蚌向雄蚌逆转,其中19℃和27℃影响更大,且性腺发育早期更易受影响。Tra2a、Fem1b、Sox9、Dmrt1、Foxl2五个基因均参与温度诱导池蝶蚌生殖滤泡分化,其中Dmrt1影响明显。4、池蝶蚌Dmrt1基因在性腺组织中的定位表达本研究利用原位杂交技术对Dmrt1 mRNA进行细胞定位,利用Western blot对31月龄雌、雄和雌雄同体蚌性腺组织的DMRT1蛋白定量,结果显示:Dmrt1mRNA阳性信号主要定位在精原细胞、“桑葚胚”结构和成熟卵母细胞中;Dmrt1基因在雌雄同体蚌内表达的蛋白量存在两个趋势:高于同期雄蚌和低于同期雄蚌。综上,池蝶蚌的生殖滤泡具有多能性,温度影响它的分化,27℃及以上的高温容易诱导雄蚌向雌蚌逆转或产生雌雄同体现象,23℃及以下的低温容易诱导雌蚌向雄蚌逆转;并且温度很可能是通过调控Dmrt1等性别相关基因的表达量,从而调节生殖滤泡分化的。