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背景外泌体(exosome)为细胞膜或多囊泡胞内体与细胞膜融合过程中所产生的分子直径30～100nm的小囊泡,在真核生物的血液、尿液和唾液等多种甚至全部体液中广泛分布。近年来针对外泌体及其所含microRNA(miRNA)的研究发现,其与乳腺癌的发病及预后关系密切,并且可能在乳腺癌的早期诊断和临床评估中发挥重要作用。截至目前,已有大量针对乳腺癌细胞外泌体miRNA的研究发现其异常表达与肿瘤的发展阶段和耐药性息息相关。遗憾的是,大多数研究都在细胞系中进行,其miRNA的变化并不能完全代表患者体内miRNA水平的波动。此外由于外泌体的研究是近年来新兴的热点,受制于样本数量及实验规模,目前多数的研究仍基于既往血浆或病理组织中的结果展开。因此在本研究中,我们将直接针对乳腺癌患者血浆外泌体的研究,采用二代测序的方法对外泌体miRNA的调控网络进行全面、深入的分析,筛选其可能的核心靶点,并尝试建立与疗效、预后等临床事件的关联。目的1)探索不同方法提取外泌体miRNA的差异,构建有临床应用价值的实验方法;2)明确外泌体miRNA在新辅助化疗效果差异的Luminal A型乳腺癌患者中的不同表达水平以及用药前后的波动,分析其可能作用的靶基因及其功能3)利用生物信息学分析乳腺癌患者血浆外泌体mirna的总谱,进一步明确其调控的靶基因的功能聚类,并基于大数据验证差异表达的靶基因。方法1)用超速离心法或试剂盒沉降法提取晚期乳腺癌患者血浆中的外泌体;通过透射电镜鉴定外泌体及Western Blot法验证外泌体标志蛋白,明确外泌体在乳腺癌患者血浆中的分布;2)用试剂盒提取外泌体总RNA,针对miRNA构建文库,进行二代测序;比较疗效不同的接受紫杉醇联合表柔比星化疗的晚期LuminaA型乳腺癌患者血浆外泌体中miRNA分布水平的差异;3)结合DIANA Tools、GO、KEGG等数据库分析血浆外泌体miRNA的靶基因及下游信号通路。结果1)由试剂盒沉降外泌体并继而使用试剂盒提取总RNA较传统的超速离心分离外泌体以及Trizol提取RNA,可获得相对更高的得率,在血样保存时间较长,总量较少的情况下仍能获得较满意外泌体RNA提取结果;2)通过文库构建及二代测序获得的所有样本的小RNA片段与miRBase数据库对比,共鉴定出1446种已知miRNA,表达量最高的miRNA中,部分如miR16、miR22已被证实在乳腺癌患者的血浆和组织中高表达;3)利用edgeR分析PR及SD病人样本间miRNA的差异表达,筛选出9个在SD组中表达显著上调的miRNA,13个明显表达下调,miR454在Kaplan Meire plot数据库中与总生存期相关(p小于0.05);而针对5位PR病人化疗前及化疗中miRNA的测定发现共6个miRNA呈下降趋势,99个miRNA呈上升趋势4)基于生物信息学分析对差异表达的miRNA靶基因进行GO聚类分析,显示这些其功能涉及RNA合成、代谢及转录、细胞发育、细胞迁移等相关的生物过程。KEGG通路分析发现,差异表达的miRNA对应的靶基因主要参与了药物代谢、GnRH、Hedgehog等信号通路;5)利用String平台进行的靶基因蛋白质互作网络构建,并通过Cytospace软件对互作网络进行拓扑结构分析,筛选出在疗效相关的miRNA调控网络中作为重要节点的CALM2、CREB1等基因以及化疗前后差异变化的miRNA所调控的节点基因 KRAS、PTEN 等;6)参考TCGA数据库中乳腺癌患者转录组与RNA测序的信息,进一步筛选与差异表达的miRNA与相关性高的靶基因,其功能聚类提示仍以大分子代谢、发育及形态发生为主,而互作网络分析则筛选出PPP2CA、IGF1等节点基因;7)探索差异表达的miRNA及节点基因TCGA数据库中Luminal A型乳腺癌样本的表达水平,miR184、miR144及KITLG在不同分期病人中的表达水平具有差异性。结论1)试剂盒沉降外泌体并继而使用试剂盒提取总RNA,在血样保存时间较长,总量较少的情况下仍能获得相对较高的得率;2)二代测序筛选出22个在PR及SD的病人样本间差异表达的miRNA,其中2个在KaplanMeireblot数据库中与总生存期相关,2个在TCGA中得到验证;针对5位PR病人化疗前及化疗中差异表达的miRNA共发现2个miRNA呈下降趋势,60个miRNA呈上升趋势;3)差异表达的miRNA其靶基因主要与参与大分子合成代谢、细胞发育相关,并参与药物代谢、GnRH等信号通路,在其构成的互作网络中,CALM2、CREB1等基因为疗效差异相关的miRNA的主要作用节点,KRAS等基因为化疗前后差异表达的miRNA的主要作用节点;4)在TCGA数据库中呈现高相关性的靶基因功能以大分子代谢、发育及形态发生为主,PPP2CA、IGF1等为网络中的关键节点;miR184、miR144及KITLG在不同分期的Luminal A型乳腺癌样本中存在差异表达。