结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性致死性人兽共患性传染病。该病传染性强，潜伏期长，致死率高，是严重危害人类健康的三大传染性疾病之一。牛分枝杆菌减毒株 BCG（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin，BCG）作为目前唯一的抗结核疫苗，在全世界范围内广泛使用，对人类预防结核病发挥了巨大的作用，但其所能提供的免疫保护力有限。虽然目前已经有很多新型抗结核疫苗处于实验研究阶段，但是仍然没有新疫苗可取代 BCG。鉴于目前抗结核病疫苗的研究现状，为了能诱导机体产生更有效的免疫应答，近年来，国内外学者开展了病毒载体疫苗的研究，其中腺病毒载体是颇受关注的研究热点之一。本论文的目的在于采用人5型腺病毒（Human adenovirus serotype5，Ad5）构建共表达结核分枝杆菌优势抗原基因CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B的重组腺病毒载体Ad5-CEAB，并以小鼠为动物模型研究重组腺病毒Ad5-CEAB的免疫原性，这不仅具有重要的科学意义，研究结果也将为抗结核新型疫苗的研制提供理论依据。　　首先，我们选取了4种结核分枝杆菌优势抗原 CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B基因，构建了一种可同时表达这4种抗原的真核多基因共表达载体pcDNA-CMV-CFP10-linker-ESAT6-RSV-Ag85A-IRES-Ag85B（pcDNA-CEAB）。测序验证后再用限制性内切酶将 CFP10-linker-ESAT6-RSV-Ag85A-IRES-Ag85B片段整体从质粒pcDNA-CEAB中切下，插入到腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA vector中，与腺病毒骨架质粒pacAd59.2-100 Ad backbone vector共转染HEK293T细胞进行病毒包装，获得重组腺病毒Ad5-CEAB。重组腺病毒Ad5-CEAB经Western blotting验证后进行大量扩增，并用氯化铯密度梯度离心法进行病毒纯化，获得了高滴度的重组病毒Ad5-CEAB。　　然后，我们以小鼠为动物模型对重组腺病毒Ad5-CEAB的免疫原性进行了评价。实验以PBS和BCG作为对照，用Ad5-CEAB免疫小鼠3次，末免2周后处死小鼠进行免疫学评价。结果表明，Ad5-CEAB可以刺激小鼠产生较强的抗原特异性免疫应答反应，尤其是Th1型细胞免疫应答反应。表现在，Ad5-CEAB免疫小鼠后，淋巴细胞抗原刺激液中的IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12浓度显著高于PBS组和BCG组。另外，Ad5-CEAB组小鼠血清抗体IgG和IgG2a/IgG1显著高于对照组。实验还测定了小鼠呼吸道黏膜分泌型IgA（secretary IgA，sIgA）的浓度，结果显示，Ad5-CEAB组小鼠肺盥洗液中sIgA的浓度显著高于对照组。总之，Ad5-CEAB免疫小鼠后，能够刺激小鼠产生较强的呼吸道黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，这些指标和对照组相比，均有显著的变化。　　最后，我们以小鼠为动物模型，采用BCG初免-Ad5-CEAB加强的异源初免-加强的免疫策略，评价Ad5-CEAB作为BCG的加强型候选疫苗，是否具有加强BCG免疫效果的作用。结果表明，Ad5-CEAB可以显著的加强BCG的免疫效果。主要表现在，BCG初免-Ad5-CEAB加强免疫后，小鼠淋巴细胞经抗原刺激后，会分泌高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，这三种细胞因子的浓度均显著高于PBS组和BCG组。BCG初免-Ad5-CEAB加强后，还可以有效的刺激小鼠分泌IgG抗体，血清IgG抗体浓度显著高于对照组。另外，小鼠肺盥洗液中sIgA浓度也显著高于对照组。说明采用BCG初免-Ad5-CEAB加强的异源初免-加强的免疫策略能够有效的刺激小鼠产生呼吸道黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答。此外，我们还比较了BCG初免后，用Ad5-CEAB加强1次和加强2次的免疫效果。结果表明，Ad5-CEAB加强1次也能刺激小鼠产生较强的免疫应答反应，尤其是黏膜免疫应答和细胞免疫应答。　　综上所述，本论文成功的构建了重组腺病毒载体Ad5-CEAB，该病毒采用了双启动子表达的策略，利用CMV启动子和(Gly4Ser)3蛋白linker实现了CFP10和ESAT6的融合表达，利用RSV启动子和IRES序列实现了Ag85A和Ag85B蛋白的独立表达。最终，在同一个病毒载体中共表达了4种结核分枝杆菌优势抗原基因。通过动物实验证明我们构建的重组腺病毒Ad5-CEAB具有很强的刺激机体产生局部黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答反应的能力。另外，Ad5-CEAB还可以加强BCG的免疫效果。本研究制备的重组腺病毒载体Ad5-CEAB被实验证明具有很好的免疫原性。我们将在以后的研究中继续对Ad5-CEAB开展深入的研究，主要包括在其他动物模型中继续验证，条件成熟后进行强毒株攻毒保护实验等。Ad5-CEAB有望成为一种新型的抗结核候选疫苗，BCG初免-Ad5-CEAB加强的异源初免-加强的免疫策略也有望成为一种新型的抗结核免疫策略，值得更进一步的研究。