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马铃薯淀粉具有许多优良的特性,它被广泛应用于造纸、食品、胶粘剂和制药等行业。但由于在理化性质方面的一些局限性,在工业应用中天然淀粉不能很好地发挥其作用,因此,天然淀粉被利用前通常要用化学或物理方法进行改性处理。天然淀粉的化学或物理改性的成本昂贵,并且使用的化学物质经常是有害的。利用基因工程的方法在植物体内对淀粉的组成和结构进行修饰,可以获得新的功能淀粉。以前的研究表明,SBD(starch-binding domain,淀粉结合结构域)-平台技术能有效地将人工构建的颗粒结合型重组蛋白在淀粉生物合成过程中定位到淀粉颗粒中,从而对淀粉的组成和结构进行修饰。在这个平台技术中,环状芽孢杆菌环糊精糖基转移酶的淀粉结合结构域(SBD)被用作"锚"。黑曲霉糖化酶的淀粉结合结构域(glucoamylasestarch-binding domain,GASBD)和环状芽抱杆菌环糊精糖基转移酶的淀粉结合结构域(SBD)同属于CBM20家族的成员,它们的三维结构和淀粉结合位点相似。本研究以黑曲霉糖化酶的淀粉结合结构域为材料进行了相关的研究。主要研究结果如下:1.串联重复的GASBDs蛋白与淀粉的亲和性采用PCR的方法从黑曲霉2316菌株中将糖化酶淀粉结合结构域(GASBD)的编码区扩增出来并进行测序。测序结果(GenBank登录号为JQ814697)表明,GASBD基因的编码区含有324bp的核苷酸序列,编码由108个氨基酸组成的多肽。序列同源性分析表明,GASBD属于CBM20家族的成员。为了研究人工构建的串联重复的GASBDs蛋白在体外与不溶性淀粉的亲和力,构建了4个pET28a系列的表达质粒,分别携带单个GASBD基因和2-4个串联重复的GASBDs基因。通过Ni2+-NTA亲和层析的方法对在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达的重组蛋白GASBD(s)进行了纯化,并对纯化的重组蛋白GASBD(s)与不溶性淀粉的亲和力进行了测定。结果显示,GASBD2、GASBD3和GASBD4蛋白与不溶性淀粉的亲和力大约是GASBD蛋白与淀粉亲和力的5、8和10倍。这表明,当与不溶性淀粉结合时GASBDs蛋白中的不同GASBD重复之间具有协同增效作用。2.GASBD和GASBD2基因在马铃薯中的表达将单个GASBD基因或串联重复的GASBD2基因的编码序列同马铃薯颗粒结合型淀粉合成酶Ⅰ(granule-bound starch synthaseⅠ,GBSSI)的转运肽序列融合。采用农杆菌介导的方法将GASBD基因和GASBD2基因分别转入马铃薯栽培品种Desiree中,在马铃薯GBSSI启动子的驱动下,它们能在马铃薯块茎中表达。为了确定GASBD或GASBD2蛋白是否能够在淀粉生物合成过程中定位到淀粉颗粒中,用Western斑点杂交的方法对转基因系淀粉中GASBD或GASBD2重组蛋白的积累量进行了分析。结果表明,GASBD和GASBD2蛋白都能在淀粉颗粒中积累,并且GASBD2蛋白在转基因系淀粉中的最高积累量大约是GASBD蛋白最高积累量的3倍。转基因系薯块的淀粉含量没有变化,这表明GASBD和GASBD2蛋白的表达对淀粉的生物合成没有影响。此外,对GASBD或GASBD2蛋白在淀粉颗粒中的积累对转基因系淀粉的颗粒形态和理化性质的影响进行了研究,结果发现,GASBD蛋白在淀粉颗粒中的积累对转基因系淀粉的颗粒形态没有明显的影响,但GASBD2蛋白在淀粉中的积累对转基因系淀粉的颗粒形态有明显影响。淀粉的其它理化性质在转GASBD或GASBD2基因系淀粉与它们的对照淀粉之间没有差异。这些结果表明,GASBD和GASBD2可以用于对淀粉进行修饰的SBD-平台技术。3.glgB/GASBD融合基因在马铃薯中的表达以前的研究表明,大肠杆菌糖原分支酶(glycogen branching enzyme,glgB)基因在马铃薯块茎中表达能导致转基因系淀粉的分支程度增加。在本研究中,为了得到淀粉分支程度比以前更高的转基因马铃薯淀粉,将大肠杆菌glgB基因融合到GASBD基因的5’-端或3’-端。采用农杆菌介导的方法将glgB/GASBD融合基因和用于对照的glgB基因分别转入马铃薯栽培品种Desiree中,在马铃薯GBSSI启动子的驱动下,它们能在马铃薯块茎中表达。采用Western斑点杂交的方法对淀粉颗粒中glgB/GASBD融合蛋白的积累量进行了分析,结果发现有大量的glgB/GASBD融合蛋白积累到淀粉颗粒中,并且GASBD在融合蛋白中的位置(在N-末端或在C-末端)对融合蛋白在淀粉颗粒中的积累没有明显的影响。glgB/GASBD融合基因在马铃薯块茎中表达导致一些转基因株系的淀粉分支程度与非转基因的对照淀粉相比增加了35%。但与转glgB基因系的淀粉相比,转glgB/GASBD融合基因系淀粉的分支程度没有明显增加。转基因系薯块中淀粉含量的测定结果表明,glgB/GASBD融合蛋白或glgB蛋白的表达对淀粉的生物合成没有影响。但glgB/GASBD融合蛋白在淀粉颗粒中的积累导致转基因系淀粉的颗粒形态发生了改变。支链淀粉的链长分布的测定结果表明,与非转基因的对照淀粉相比,淀粉分支程度增加的转基因系淀粉的支链淀粉分子中含有更多的短链,即所谓的A链。这可能是转基因系淀粉的分支程度增加的主要原因。对淀粉分支程度的增加对转基因系淀粉理化性质和功能特性的影响进行了研究,结果显示淀粉分支程度的增加导致转基因系淀粉的峰值粘度和回生值降低。与非转基因的对照淀粉相比,转基因系淀粉的糊化温度降低了 2-3℃,并且淀粉的糊化焓变也降低了。转基因系淀粉的透明度降低而转基因系淀粉的冻融稳定性增加。这些结果表明,淀粉分支程度的增加会导致淀粉的理化性质和功能特性发生特定变化。