研究背景及目的:经美国FDA批准,全身麻醉药丙泊酚于1989年正式上市,是具有里程碑意义的事件。自此丙泊酚凭借其起效快、无蓄积、恢复迅速等优势,在临床上广泛应用。目前世界范围内每年有上千万例外科手术在丙泊酚麻醉下进行。丙泊酚已成为临床应用最为广泛且不可或缺的全身静脉麻醉药物。然而和其他全麻药一样,丙泊酚的麻醉作用机制至今仍然不清楚。揭示全麻机理是神经科学和麻醉学的梦想。2005年《Science》杂志主编Donald Kennedy将全麻机理列为学术界今后100年面临的125个世纪难题之一[1],攻破该堡垒亦将成为神经科学和麻醉学领域里程碑式的飞跃。全麻引起的可逆性意识消失作为大脑的特殊非生理状态,与学习记忆、睡眠觉醒等大脑高级功能息息相关[2]。近年来越来越多的研究结果支持全麻药物的作用机制并非以往认为的——麻醉药物对大脑整体的非特异性广泛抑制,而是由各解剖位置、功能特点不同的神经回路构成的复杂网络协同参与麻醉药物引起的大脑功能可逆性改变[3-4],即麻醉药物通过作用于特定大脑区域,阻断不同脑区的功能联系,打破信息在高级中枢的正、负反馈平衡而发挥麻醉作用。Ying的研究提示丘脑网状核(thalamic reticular nucleus,TRN)在丙泊酚的全麻机理中发挥了重要作用[5]。然而,丙泊酚是否以及如何作用于TRN并产生麻醉作用仍然不清楚。TRN在大脑信息调控中的地位极其特殊。它由GABA能抑制性神经元组成,调控丘脑-皮层环路,是网状上行激动系统的一部分。自2011年起,陆续有文献报道通过光遗传、电生理等技术发现TRN内部存在不同的功能性子网,即TRN各个亚核团的GABA能神经元投射至丘脑及皮层的不同区域并发挥不同的生理作用[6]。由于TRN特殊的解剖位置、生理功能,并且和睡眠、觉醒、意识等大脑功能密切相关,启发并促使我们探索它在麻醉这个无知觉、无意识、类似而有别于睡眠的特殊非生理状态中所起的作用。本课题致力于探索TRN内部亚核团参与丙泊酚发挥麻醉作用的具体分子、细胞、网络及行为机制,为丙泊酚中枢麻醉的网络学说及相关核团定位提供新的依据和方向。研究方法:(1)使用鹅膏蕈氨酸分别对TRN各亚核团进行化学性毁损,检测核团毁损后大鼠对丙泊酚麻醉的反应及敏感性改变。(2)利用即刻表达基因C-Fos和GAD-67免疫荧光共标检测TRN头端(anterior thalamic reticular nucleus,a TRN)和TRN尾端(posterior thalamic reticular nucleus,p TRN)的GABA能神经元在清醒、丙泊酚麻醉、麻醉复苏三个阶段的功能状态。(3)通过分子免疫学方法验证丙泊酚的主要分子靶点GABAa受体β3亚基(GABAa receptor-β3 subunit,GABAa R-β3)在TRN各亚核团中的存在和分布。(4)在大鼠双侧a TRN处注射GABAa受体竞争性拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline,BIC)阻断该受体,观察其行为改变。待大鼠状态平稳后,检测其对丙泊酚麻醉的反应及敏感性改变。(5)制备针对GABAa R-β3的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)病毒,下调a TRN处GABAa R-β3的表达。免疫印迹法验证病毒干扰效果。待病毒起效后检测大鼠对丙泊酚麻醉的反应及敏感性改变。研究结果:(1)TRN各亚核团被化学性毁损后,仅a TRN毁损组大鼠对丙泊酚的敏感性有明显且持续的提高(1)a TRN毁损组大鼠相较于对照组大鼠在接受丙泊酚静脉泵注后翻正反射消失(lost of righting reflex,LORR)的时间缩短并维持该状态,即a TRN毁损组大鼠对丙泊酚的敏感性有明显且持续的提高;a TRN毁损组大鼠对性质不同的静脉麻醉药物(右美托咪定)的敏感性无明显变化。(2)p TRN毁损组大鼠相较于对照组大鼠接受丙泊酚及右美托咪定静脉泵注后LORR时间均无明显变化。(2)a TRN与p TRN的GABA能神经元在清醒、麻醉和复苏三个阶段呈现相反的功能状态(1)a TRN的GABA能神经元在清醒时活跃,而在丙泊酚麻醉后处于相对抑制状态。(2)p TRN的GABA能神经元在丙泊酚麻醉后被明显激活,而撤药苏醒后则处于相对抑制状态。(3)a TRN和p TRN均表达丙泊酚作用靶点GABAa R-β3且a TRN的表达量较p TRN更为丰富且密集(1)采用免疫印迹法验证抗GABAa R-β3抗体的特异性并使用该抗体检测GABAa R-β3在a TRN、p TRN、丘脑、海马、皮层等脑组织的表达。结果显示a TRN和p TRN区域均存在GABAa R-β3的蛋白表达。(2)免疫荧光检测结果显示,GABAa R-β3在a TRN和p TRN均有一定分布;在相同视野下,GABAa R-β3在a TRN的表达量较p TRN更为丰富且密集。(4)拮抗a TRN的GABAa R及下调a TRN处GABAa R-β3的表达使大鼠对丙泊酚敏感性下降(1)大鼠双侧a TRN处注射GABAa受体拮抗剂BIC阻断该受体,动物即刻行为活跃,活动度明显增加。(2)BIC注射组大鼠相较于对照组大鼠在接受丙泊酚静脉泵注后LORR时间明显延长,即BIC注射组大鼠对丙泊酚敏感性下降。(3)针对GABAa R-β3的si RNA病毒下调a TRN处该蛋白的表达,病毒干扰组大鼠较对照组大鼠在接受丙泊酚静脉泵注后LORR时间明显延长,即病毒干扰组大鼠对丙泊酚敏感性下降。结论:a TRN的神经元被化学性毁损后,动物对丙泊酚的敏感性有显著且持续的提高,而毁损其它部位则无类似变化。这提示a TRN极有可能参与丙泊酚对中枢神经系统发挥麻醉作用的过程。C-Fos和GAD-67免疫荧光共标发现a TRN与p TRN的GABA能神经元在清醒、麻醉、复苏三个阶段显示出相反的功能状态,表明TRN各亚核团在丙泊酚麻醉过程中发生了不同的功能变化。BIC阻断a TRN的GABAa R后动物即刻表现出亢奋状态,即a TRN的GABA能神经元兴奋性升高使动物呈现与麻醉相反的行为学表现。BIC注射组相较于对照组,大鼠对丙泊酚敏感性下降。推测一方面a TRN处的GABAa R可能是丙泊酚的作用靶点,其被拮抗剂阻断后使丙泊酚麻醉效能降低;另一方面a TRN的GABA能神经元兴奋性升高可能对抗丙泊酚的麻醉作用。免疫荧光结果显示GABAa R-β3在a TRN处相较于p TRN有着更为丰富且密集的表达,在形态学角度支持a TRN作为丙泊酚麻醉神经网络相关核团的特殊性。利用si RNA病毒下调GABAa R-β3的表达,病毒干扰组大鼠相较于对照组大鼠对丙泊酚敏感性下降。进一步证明a TRN处的GABAa R-β3对丙泊酚发挥麻醉作用至关重要。综上所述,我们推测丙泊酚极有可能通过与位于a TRN的GABAa R-β3结合后,抑制了该处GABA能神经元(a TRN的GABA能神经元兴奋性下降),从而使其下游、处于p TRN的GABA能神经元去抑制。p TRN的GABA能神经元兴奋性升高,其轴突末梢发放更多的抑制性信号到丘脑和皮层,最终产生麻醉镇静作用(参见假说示意图)。