近年来的研究结果显示吴茱萸碱（Evodiamine,EVO）具有多种多样的生物活性,例如舒张血管、抗炎、抗肿瘤等^[1-3]。研究发现EVO可以通过抑制炎症反应进而抑制由紫杉醇治疗产生的疼痛,因此EVO还是一种潜在的治疗化疗所致神经性疼痛（Chemotherapy-induced neuropathic pain,CINP）的药物。Yang等发现EVO不仅仅可以抑制STAT3的磷酸化,也能抑制由IL-6诱导的STAT3激活,进而显著地抑制肝癌细胞的生长^[4]。尽管已有文献报道EVO具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、逆转耐药等作用,但目前尚没有关于EVO在体内体外对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制的相关报道^[5-7]。在酵母菌中,Sir2（silent information regulator 2）是一种NAD⁺依赖的组蛋白去乙酰化酶,能沉默染色质、延长生命周期、增强遗传稳定性。在哺乳动物中,Sirtuins其作为Sir2的同源物,具有类似Sir2的功能,包括Sirt1-Sirt7七个亚型。其中,Sirt1与Sir2有着最高的同源性,属于第三类组蛋白去乙酰化酶^[8]。由于Sirt1既可以存在于细胞质中也可以存在于细胞核内,因此它能去乙酰化多种组蛋白和非组蛋白,非组蛋白包括p53,p300,c-MYC和Nuclear factor-κB（NF-κB）等^[9-11]。NF-κB是一种普遍存在于胞浆中的一种核转录因子,与NF-κB的抑制性蛋白IκBα结合而呈非活性状态。近年来大量文献显示它与肿瘤的发生、增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭息息相关^[12-14]。研究发现乙酰化的NF-κB无法与IκBα结合,可暴露出其核定位信号并进入细胞核内,与特定基因的启动子区域结合,启动促进肿瘤细胞增殖侵袭转移等特定基因的转录,如IL-6和TNF-α,VEGF,IL-1β,TF和MMPs等^[15,16]。而Sirt1可以在NAD+的帮助下去乙酰化NF-κB p65,阻止其进入细胞核,并抑制其转录活力。本研究着重于研究EVO对结肠癌细胞迁移、侵袭的影响及EVO作用下的Sirt1和NF-κB p65的转录活力之间的相互联系,旨在探究EVO调控结肠癌迁移和侵袭的机制。目的本研究第一部分以人结肠癌（carcinoma of colon and rectum,CRC）细胞株HT-29、HCT-116为研究对象,检测EVO对于CRC迁移和侵袭的影响,并研究EVO对于小鼠体内CRC转移的作用;第二部分研究EVO抑制CRC迁移和侵袭的机制。方法第一部分:体外培养CRC细胞株HT-29、HCT-116细胞,运用CCK-8法检测EVO对于结肠癌细胞增殖的影响,划痕实验及Transwell法分析EVO对于HT-29、HCT-116细胞迁移及侵袭的影响,利用BALB/c裸鼠尾静脉注射HCT-116细胞,建立CRC转移模型,灌胃EVO,实验期间每隔三天测量小鼠体重,实验结束后处死小鼠,计数小鼠肺部、肝部的转移结节数。第二部分:运用RT-PCR方法检测迁移与侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶MMP-9的mRNA表达;荧光法检测EVO对于CRC细胞NAD⁺/NADH比值的影响;Western blot检测EVO对于HT-29、HCT-116细胞去乙酰化蛋白Sirt1,转录因子NF-κB p65和acetyl-NF-κB p65,迁移相关蛋白MMP-9表达的影响;免疫荧光法检测EVO对于HT-29、HCT-116细胞Sirt1蛋白表达以及细胞定位的影响;Sirt1抑制剂NAM预处理细胞后,Western blot检测EVO单独或者联合NAM使用对于HT-29、HCT-116细胞去乙酰化蛋白Sirt1蛋白、NF-κB p65和乙酰化修饰的acetyl-NF-κB p65、迁移相关蛋白MMP-9表达的影响。结果第一部分1.CCK-8结果显示:EVO能显著地抑制结肠癌细胞HT-29、HCT-116的增殖,且呈时间和浓度依赖性;2.划痕实验结果显示:EVO能显著地抑制HT-29、HCT-116的迁移能力;3.Transwell结果显示:EVO能有效地抑制HT-29、HCT-116的侵袭能力;4.体内实验结果显示:EVO组的小鼠体重显著高于对照组的小鼠体重;EVO组的小鼠肺部结节数和肝部结节数均显著地低于对照组;第二部分1.RT-PCR结果显示:EVO能明显地抑制HT-29、HCT-116的MMP-9的mRNA的表达,且呈浓度依赖性;2.荧光法结果显示:EVO能提高HT-29、HCT-116细胞NAD⁺/NADH的比值。3.Western-blot结果显示:EVO不影响转录因子NF-κB p65的表达,但Sirt1的表达显著上升,acetyl-NF-κB p65和MMP-9的蛋白水平显著下调。4.免疫荧光法结果显示;EVO能上调Sirt1的表达,并诱导Sirt1从细胞质进入细胞核。5.Sirt1抑制剂NAM处理结果显示:在EVO+NAM组中,NAM抑制了Sirt1的蛋白水平,acetyl-NF-κB p65和MMP-9的蛋白表达相对于EVO单独处理组显著上升。结论1.EVO能有效地抑制结肠癌的增殖,并抑制CRC在体外的迁移与侵袭;在体内实验中通过尾静脉注射HCT-116细胞建立结肠癌转移模型,EVO可以有效地减少结肠癌细胞在肺部、肝部形成转移结节。2.EVO能促进Sirt1的表达并可通过上调NAD⁺/NADH的比值来激活Sirt1,Sirt1可去乙酰化NF-κB p65抑制其转录活性,进而下调相关蛋白的转录,抑制CRC的迁移与侵袭;在经Sirt1的抑制剂NAM处理后,EVO对NF-κB p65通路的抑制作用被削弱。