不同转移能力卵巢癌细胞系的microRNA和基因表达谱研究

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目的与背景:应用Affymetrix公司芯片技术对不同转移能力的卵巢癌细胞系的microRNA表达谱及其基因表达谱进行研究,并对其中的某些microRNA靶基因进行预测,来探讨卵巢癌转移过程microRNA对其转移能力的影响。方法:1.应用Affymetrix公司microRNA芯片技术来检测不同转移能力卵巢癌细胞系的microRNA表达谱2.应用Affymetrix公司基因外显子芯片技术来检测不同转移能力卵巢癌细胞系的基因表达谱3.我们运用半定量PCR方法对microRNA芯片及基因芯片结果进行验证,分别以不同转移能力卵巢癌细胞系总RNA为模板,反转录后得到let-7a、 Hsa-miR-27a、 Hsa-miR-181b、 Hsa-miR-34a、 CD44、 MUC16的cDNA模板,利用特异性定量PCR引物,凝胶电泳,对这些microRNA和基因的相对表达量进行分析。4.实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)对:nicroRNA芯片及基因芯片结果进行验证,分别以不同转移能力卵巢癌细胞系总RNA为模板,反转录后得到let-7a、 Hsa-miR-27a、 Hsa-miR-181、 Hsa-miR-34a、 CD44、 MUC16的cDNA模板,利用SsoFast EvaGreen supermix和特异性定量PCR引物,对这些microRNA和基因的相对表达量进行分析。5.蛋白免疫印迹方法(Western-blot)对基因芯片结果进行验证,分别提取不同转移能力卵巢癌细胞系总蛋白,经电泳、转膜、CD44抗体孵育,DAB染色,利用软件对CD44蛋白的相对含量进行分析。6.通过芯片结果、不同实验方法的验证结果及软件分析,选择与卵巢癌转移相关的microRNA及基因,并对其表达水平进行比较分析,预测microRNA对其表达调控的靶基因在卵巢癌转移过程中起到的作用。结果:1.microRNA芯片结果显示HO-8910PM与HO-8910相比(差异倍数>2/差异倍数<0.5)有15个显著差异的microRNA,其中上调的有3个:miR-423-5p, miR-181b andmiR-122。下调的有12个:miR-25, miR-34a, miR-886-3p, miR-1274b, miR-27a, miR-15b, miR-29a, miR-19b, miR-130a, miR-210, miR-16, let-7a.2.基因芯片结果显示HO-8910PM与HO-8910相比(差异倍数>2/差异倍数<0.5)有191个显著差异,其中101个基因显著上调,90个基因显著下调。3.半定量PCR、qRT-PCR及Western-blot方法分别验证了不同的microRNA及基因,结果显示microRNA芯片及基因芯片结果可靠。4.相关文献显示CD44与卵巢癌的转移密切相关,通过软件分析及负相关分析结果显示let-7a可能在CD44调控卵巢癌转移的过程中起到一定的调控作用。
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