癌症作为世界上最致命的疾病之一,仍然是一个非常严重的健康问题。尽管人们在开发新的肿瘤治疗方法上投入了大量的人力、物力和财力,但由于肿瘤的复杂性、多样性和异质性,目前的临床治疗方案取得的成果依然有限。因此,恶性肿瘤的早期诊断和临床治疗仍然是一个亟待解决的问题。肿瘤治疗面临的第一个问题就是如何实现肿瘤的精确诊断。一方面,在肿瘤发病的早期阶段,肿瘤患者并无明显的不适和异常现象,错过了最佳的治疗时期;另一方面,当确诊之后,大部分患者已进入肿瘤发展的中晚期,肿瘤已经发生了浸润和转移,而现今的治疗手段难以对中晚期的肿瘤增殖产生行之有效的抑制或杀死效果。为了尽早地发现和诊断恶性肿瘤,研究者致力于开发细胞水平上肿瘤标志物的成像分析方法。肿瘤标志物的概念自1978年提出以来,已经成为肿瘤诊断的一个重要工具。由于肿瘤标志物的含量远超正常人体内的含量,因此通过检测肿瘤标志物可以为肿瘤的早期诊断提供可靠有效的信息。针对肿瘤标志物的检测方法有很多,包括电化学方法、色度法、质谱法、化学发光及表面增强拉曼散射等方法,这些方法在肿瘤标志物的检测方面取得了很大进展,但是这些方法大部分只能对体外的肿瘤标志物进行检测,无法对活细胞内的肿瘤标志物进行实时成像。为解决这一问题,很多纳米材料,比如脂质体、硅纳米颗粒、金纳米颗粒、量子点、氧化石墨烯、二氧化锰纳米片等被开发用于构建活细胞内肿瘤标志物的原位成像分析。这些方法均取得了很好的研究成果,但是这些方法也存在着一些不足,比如脂质体的包封是杂乱无序的,递送进细胞的核酸探针也容易受到酶解的影响;而基于无机纳米材料的荧光探针又往往存在潜在生物毒性及合成修饰复杂的缺点,因此寻找生物相容性好、合成修饰简单、稳定性好的载体用于构建活细胞中肿瘤标志物的原位成像具有重要意义。近年来,DNA纳米结构,比如DNA四面体、DNA三棱柱、DNA纳米球等因其优异的单分散性、良好的生物相容性、修饰的简单可操作性、优异的核酸稳定性等优点而广泛用于活细胞内肿瘤标志物的成像分析。但是这类探针大部分只针对某一特定肿瘤标志物进行成像分析,肿瘤诊断准确性尚显不足。因为一种肿瘤可以同时产生多种不同的肿瘤标志物,而不同的肿瘤或者相同肿瘤的不同类型也可以产生同一种肿瘤标志物,因此单一肿瘤标志物的成像分析方法往往难以得到准确的诊断结果。因此,开发活细胞内多种肿瘤标志物的同时成像分析方法对于提高肿瘤诊断的准确性具有重要意义。最后,化疗作为目前肿瘤治疗应用最广泛的方式之一,虽然在肿瘤治疗和延长患者生命方面取得了显著的成果,但是依然存在不少的问题,其中之一便是化疗所产生的毒副作用。因此,通过对载药体系的功能化设计,建立肿瘤标志物识别及触发的可控药物释放系统,不仅可以对活细胞内的肿瘤标志物进行成像分析,起到肿瘤诊断的目的;又可以对药物的释放及肿瘤治疗过程进行监控,对提高肿瘤靶向治疗效果具有重要意义。针对上述问题,本论文主要围绕DNA纳米结构开发了用于多种肿瘤标志物成像分析的荧光探针,并在此基础上设计了肿瘤标志物指导下的靶向可控药物释放策略用于肿瘤的精准治疗。具体的工作如下:1.基于DNA四面体上的CHA循环实现两种miRNA的精准成像微小核糖核酸（micro RNA,miRNA）的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关,因此建立miRNA的原位成像分析方法对于肿瘤的早期诊断具有重要意义。在这项工作中,我们设计了一个基于DNA四面体的荧光探针用于细胞内两种miRNA的成像分析。我们分别在DNA四面体的四个顶点连接上能够靶向核仁素的核酸适配体AS1411、催化发卡自组装（CHA）的两条发卡DNA,以及一条捕获链。而捕获链上连接有一条引发链和一条封锁链。该DNA四面体荧光探针可以通过AS1411与核仁素的特异性识别靶向进入肿瘤细胞;而只有当肿瘤细胞中同时存在miR-21和miR-155时,捕获链才能分别与两种miRNA杂交,释放出引发链;释放的引发链可以进一步触发DNA四面体内的CHA循环,使修饰在两个发卡DNA上的供受体荧光分子相互靠近,从而产生明显的荧光共振能量转移（FRET）信号,实现活细胞中两种miRNA的成像分析。通过结合核仁素靶向、四面体内的CHA循环及两种miRNA成像,本设计有望提高miRNA相关肿瘤诊断的准确性。2.基于DNA纳米片的AND逻辑门用于两种miRNA的精准成像基于FRET的比率型荧光探针可以同时观察到供受体的荧光强度变化,能够有效避免假阳性信号,因此广泛应用于肿瘤标志物的成像分析及肿瘤诊断。但是,目前常用的荧光探针都是基于供受体在10 nm以内的研究,限制了其在更长距离的应用。在这项工作中,我们以可编程的DNA纳米片为模板,研究了不同供受体在不同距离及不同构型下的能量转移效率。通过合理的设计,我们构建了基于Alexa fluor 430/Cy3、Cy3/Cy3、Cy3/Cy5三对能量转移供受体之间的级联长程共振能量转移系统。在此基础上,我们用BHQ2分子猝灭两个Cy3分子的荧光,进一步构建了以DNA纳米片为模板,基于级联长程共振能量转移的AND逻辑门系统。只有在设计的miR-21和miR-155两个输入信号同时存在时,该AND逻辑门系统才能产生输出信号,从而实现活细胞中两种miRNA的同时成像。这项工作有望拓宽级联长程荧光共振能量转移在肿瘤标志物的检测及肿瘤诊断中的应用。3.核仁素靶向和端粒酶响应可控药物释放的DNA纳米管用于肿瘤精准治疗肿瘤的精确诊断和精准治疗是提高肿瘤治疗疗效的重要保障。在这项工作中,我们开发了一种核仁素靶向及FRET信号指示端粒酶响应可控药物释放的DNA纳米管,可以同时实现端粒酶的检测及精准的肿瘤治疗。首先,我们通过DNA自组装合成了DNA纳米片,并通过碱基互补配对负载核酸修饰的抗肿瘤药物蓖麻毒素A链（RTA）;随后,再通过Cy3分子标记的拉链DNA与纳米片两侧的端粒酶引发链和Cy5标记的单链结合将DNA纳米片卷曲成DNA纳米管,由于Cy3和Cy5的相互靠近,此时可以观察到明显的FRET信号。最后,再在纳米管的两端修饰上核仁素的核酸适配体,从而制备出核仁素靶向及端粒酶响应释放RTA的DNA纳米管。在核仁素的介导下,纳米管可以特异性地进入肿瘤细胞;进入肿瘤细胞中的纳米管可以进一步对胞质中过表达的端粒酶产生响应,重新转换成纳米片并带来明显的FRET信号改变。而暴露在胞质中的RTA可以进一步从纳米片上释放以发挥肿瘤治疗效果。而即使有部分纳米管进入了正常细胞,但由于正常细胞缺乏足量的端粒酶,纳米管也不会被打开,从而大大降低肿瘤治疗的毒副作用。这项工作通过设计核仁素靶向、端粒酶响应药物释放的DNA纳米管,有望在降低药物毒副作用的同时增加药物的治疗疗效。综上所述,在本研究中,我们构建了可用于多种肿瘤标志物成像分析的DNA纳米结构;并在此基础上建立了肿瘤细胞靶向及肿瘤标志物可控药物释放的DNA纳米管用于肿瘤的精准治疗。首先,我们以DNA四面体为载体,构建了肿瘤细胞靶向及四面体内的CHA循环放大荧光探针用于活细胞中两种miRNA的同时成像,提高了肿瘤诊断的准确性。随后,我们以DNA纳米片为模板,通过在其表面精确定位,研究了不同供受体组成下的级联长程共振能量转移,并在此基础上构建了AND逻辑门系统,用于肿瘤细胞内两种miRNA的同时成像,拓宽了级联长程FRET在肿瘤标志物检测及肿瘤诊断中的应用。最后,我们在DNA纳米片上负载RTA,并用拉链将其卷曲成DNA纳米管,通过连接核酸适配体构建了核仁素靶向、端粒酶成像及其响应下的可控药物释放DNA纳米管用于肿瘤的精准治疗。因此,本研究不仅提高了miRNA相关肿瘤诊断的准确性,还拓宽了级联长程共振能量转移在生化分析中的应用,更建立了集肿瘤标志物成像及肿瘤诊断、肿瘤标志物触发下的可控药物释放用于精准肿瘤治疗为一体的肿瘤诊疗体系,有助于提高肿瘤治疗疗效并降低毒副作用。