目的:脊髓缺血再灌注损伤（Spinal Cord ischemia-reperfusion injury,SCII）是由原发性脊髓损伤引起的继发性神经损伤,它导致运动和感觉功能障碍、截瘫、瘫痪甚至死亡。以往研究发现,SCII部位的主要免疫细胞--小胶质细胞过度活跃,通过吞噬或分泌促炎症细胞因子诱导神经元死亡,从而加重了SCII引起的继发性神经损伤。临床上用于治疗SCII的药物（右美托咪定和七氟烷）可通过抑制SCII部位的小胶质细胞的活性来改善SCII小鼠的运动和感觉功能。此外,氧自由基介导的脂质过氧化损伤和小胶质细胞中的炎症反应是SCII进展的两个主要机制。因此,抑制小胶质细胞中的氧化应激和炎症反应以改善SCII部位的运动和感觉功能是一种潜在的方法。紫苏醛（Perillaldehyde,PAH）是从紫苏中提取的一种天然单萜活性物,具有多种药理活性,包括抗炎、抗氧化、血管保护和神经保护。重要的是,PAH被报道可改善大鼠的脑缺血再灌注损伤。机制上,PAH可以通过激活不同疾病模型中的Nrf2/HO-1信号通路发挥保护作用,这表明Nrf2/HO-1信号通路可能是PAH发挥作用的潜在靶标之一。同时,Nrf2/HO-1信号通路激活对NLRP3炎性小体活化的抑制作用在脑缺血再灌注损伤模型小胶质细胞中已被证实。然而,PAH是否通过Nrf2/HO-1信号通路改善SCII进展中氧化应激和炎症反应的作用机制尚不清楚。基于上述研究进展,本论文将深入探讨PAH对SCII进展中炎症反应和氧化应激的调控作用和分子机制。本论文将分为2个部分,第一部分旨在建立SCII大鼠模型,探讨PAH是否具有预防SCII的作用。第二部分建立小胶质细胞BV2氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,研究PAH预处理对BV2细胞经OGD/R处理后Nrf2和NLRP3激活的影响,以验证PAH是否能激活小胶质细胞中的Nrf2/HO-1通路以抑制炎症反应和氧化应激,进而缓解SCII症状。研究方法:1第一部分:PAH对SCII大鼠的保护作用1.1、SCII大鼠模型构建和药物处理:雄性SPF级SD大鼠（180-200 g）购自辽宁长生生物技术股份有限公司。动物实验的所有程序都遵守美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》（第八版,2011年）,本方案得到了中国医科大学附属第一医院的批准。所有动物在22±1℃、湿度45%-55%、12 h光照/黑暗周期的条件下自由饮水和进食。适应一周后,按照随机数字表法将所有大鼠随机分为四组（每组6只SD大鼠）,分别为假手术组（Sham）、SCII组、低剂量PAH组（PAH-L）和高剂量PAH组（PAH-H）。根据以前的研究,PAH-L组和PAH-H组大鼠连续7 d胃内注射36 mg/kg和72 mg/kg的PAH,而其他组大鼠灌胃相同剂量的PAH溶剂。末次给药后进行SCII术,采用100 mg/kg戊巴比妥钠麻醉,大鼠仰卧位固定,从左肾动脉到主动脉分叉处暴露主动脉,体温保持在36.5±0.5℃。在夹住主动脉前5min,给大鼠静脉注射肝素（130 U/kg）进行抗凝。之后,使用两个牛头犬夹子从紧靠左肾动脉的下端到主动脉分叉处交叉夹住主动脉,使用激光多普勒法监视血流情况,血流降低90%视为夹闭成功。夹闭30 min后,通过移除斗牛犬夹子恢复血流,然后缝合伤口。Sham组大鼠除不进行缺血再管注步骤,其余步骤与SCII组步骤一致。除用于行为测试的大鼠外,在再灌注24 h后用200 mg/kg戊巴比妥钠安乐死。最后,收集大鼠的腰部（L2-L5段）脊髓组织以及血清样本,用于后续实验。1.2、神经学评估:各组大鼠的运动功能由Basso,Beattie和Bresnahan（BBB）分级表评估,其范围从0分表示完全截瘫到21分表示运动正常。分数在1到8之间表示大鼠肢体运动不能站立或支撑体重,代表恢复的早期阶段。分数在9到13之间表示大鼠可以站立,然后以不同程度的前肢-后肢协调迈步,代表恢复的中间阶段。分数在14至20之间表示大鼠善于行走,脚掌位置、脚趾间隙、尾巴位置和躯干稳定性逐渐改善,代表恢复的后期阶段。各组大鼠在再灌注后1、2、3和7 d,以盲法方式计算BBB评分。1.3、Hematoxylin-Eosin（HE）染色评估脊髓组织形态学:将获取的各组脊髓组织使用4%多聚甲醛固定并嵌入石蜡中。然后,将组织切成5μm厚的片子并去掉石蜡。切片用苏木精染色5 min,用曙红染色3 min,并用乙醇和二甲苯进行脱水。用中性香脂装片后,在40倍光镜下观察切片。1.4、Nissl染色分析脊髓组织神经元丢失情况:将5μm厚的离体脊髓组织使用0.5%甲酚紫在室温下染色10 min,并在0.25%醋酸乙醇中分化数秒。用乙醇和二甲苯脱水后,在Olympus BX53光镜下以40倍放大镜观察切片。1.5、Western blotting检测离体脊髓组织中NLRP3炎性小体、cleaved caspase-1、Nrf2/HO-1/NF-κB信号通路相关分子蛋白的表达水平。1.6、ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中NSE、IL-1β和IL-18的含量以及脊髓组织中IL-1β和IL-18的表达量。1.7、商业试剂盒检测各组大鼠脊髓组织中氧化应激指标（SOD、mn-SOD、GSH-Px、MDA和CAT）的含量。1.8、荧光双染法检测脊髓组织中Nrf2与Iba-1共定位情况。2第二部分:PAH通过激活Nrf2/HO-1信号通路对小胶质细胞氧化应激及炎症的调控作用2.1、细胞模型建立和药物处理:小胶质细胞BV2接种到不含葡萄糖的DMEM中,然后在37℃下在含有94%N2、5%CO2和1%O2的厌氧室中培养6 h。OGD暴露后,细胞置于含有正常空气的高葡萄糖培养基中进行24 h复氧。为了研究PAH对小胶质细胞激活的影响,在OGD/R暴露前30 min,用500μM的PAH预处理BV2细胞。2.2、MTT评估PAH对BV2细胞毒性:常规培养BV2细胞,并接种96孔板中（4×10~3个/孔）于37°C,5%CO2条件下培养,加入不同浓度（0、0.01、0.1、1、10、50、100和500μM）的PAH培养30.5 h,MTT法检测细胞活力,筛选PAH的使用剂量。2.3、小干扰RNA靶向敲降BV2细胞中Nrf2:Nrf2的小干扰序列（si Nrf2）及其阴性对照（si NC）从JTS scientific获得。将BV2细胞播种在6孔板中,在37°C和5%的CO2下培养过夜。当达到70%汇合度时,按照制造商的说明,使用Lipofectamine 2000对BV2细胞进行100 pmol si Nrf2或si NC转染。2.4、Western blotting检测BV2细胞中NLRP3炎性小体、cleaved caspase-1、Nrf2、HO-1、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白的表达水平。2.5、ELISA试剂盒检测BV2细胞中IL-1β和IL-18的表达量。2.6、商业试剂盒检测BV2细胞中SOD、mn-SOD、GSH-Px、MDA和CAT的含量。结果:1第一部分:PAH对SCII大鼠的保护作用1.1、PAH改善了SCII大鼠的神经系统运动功能和组织病理学改变与Sham组相比,SCII组的BBB评分在再灌注后1、2、3和7 d明显降低。然而,随着时间的延长,低和高剂量的PAH有效地提高了BBB评分。同时,SCII组血清中NSE水平升高,高剂量的PAH明显降低了血清NSE水平。HE染色的结果显示,SCII组的运动神经元有明显的损失,而PAH处理的SCII组则有更多完整的运动神经元,细胞质呈细颗粒状。Nissl染色的结果表明,SCII组Nissl体的数量明显减少,但PAH治疗大大缓解了神经元的损伤,表现为Nissl体的数量增加。1.2、PAH抑制SCII大鼠NLRP3炎症体的激活与Sham组相比,SCII组大鼠脊髓组织中NLRP3和cleaved caspase-1的蛋白水平明显增加,而PAH治疗可降低这些蛋白的表达。同时,促炎症细胞因子IL-18和IL-1β在PAH治疗后明显下降。1.3、PAH抑制SCII大鼠的氧化应激反应相比于Sham组,SCII组大鼠发生了氧化应激损伤,主要表现为脊髓组织中MDA含量增加,以及SOD、mn-SOD、GSH-Px和CAT活性的降低,但上述指标在PAH治疗后得到了逆转。同时,Western blotting结果显示,Nrf2和HO-1的蛋白水平明显低于Sham组,而PAH处理后这些蛋白水平升高。免疫荧光检测结果证实,用PAH治疗后,Nrf2的表达明显上调。此外,Nrf2和小胶质细胞标志物Iba-1的表达不是直接共定位的,而是与Iba-1密切相关。Western blotting结果表明,SCII组脊髓组织中p-NF-κB p65的表达明显上调,PAH处理有效地抑制了脊髓组织中NF-κB p65的磷酸化。2第二部分:PAH通过激活Nrf2/HO-1信号通路对小胶质细胞氧化应激及炎症的调控作用2.1、PAH激活OGD/R诱导的BV2细胞中的Nrf2通路MTT检测结果显示,PAH作用剂量为0-100μM范围内时,BV2细胞增殖活力没有显著变化,但PAH作用浓度为500μM时,BV2细胞活力明显下降,这表明PAH浓度在500μM时对BV2细胞有毒性。同时,BV2细胞中转染si Nrf2后,Nrf2蛋白表达水平明显下降。在OGD/R刺激下,BV2细胞中Nrf2和HO-1的蛋白水平明显下降,在PAH处理后Nrf2和HO-1蛋白水平上升,但这种增加趋势在Nrf2敲降后被逆转了。免疫荧光的结果证实,PAH激活了OGD/R诱导的BV2细胞中的Nrf2/HO-1信号通路。Western blotting检测结果显示,在OGD/R刺激后,BV2细胞中NF-κB p65的磷酸化水平增加,但PAH处理后抑制了NF-κB p65的磷酸化水平。此外,OGD/R诱导的BV2细胞中MDA含量明显增加,而SOD、mn-SOD、GSH-Px和CAT活性则下降。PAH处理明显增加了SOD、mn SOD、GSH-Px和CAT的活性,并降低了MDA含量,但这些指标在Nrf2敲降后被逆转了。2.2、PAH通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制OGD/R处理BV2细胞中NLRP3介导的炎症反应相比于对照组,OGD/R组BV2细胞中NLRP3和cleaved caspase-1蛋白表达水平明显增加,PAH处理可降低两者表达量。然而,敲降Nrf2则显著逆转了PAH干预NLRP3和cleaved caspase-1蛋白的表达水平。此外,在OGD/R诱导的BV2细胞中,IL-18和IL-1β的水平显著增加,但PAH作用后明显下降。转染si Nrf2于PAH预处理的BV2细胞后,IL-18和IL-1β的水平显著增加。结论:1、SCII模型大鼠遭受了严重的神经系统运动功能障碍和组织病理学损伤,表现为运动神经元的丧失和Nissl体的减少。2、PAH治疗可通过抑制脊髓组织氧化应激和炎症反应明显改善SCII模型大鼠运动功能障碍和神经元损伤。3、PAH（500μM）作用于小胶质细胞BV2中可产生显著毒性作用。4、PAH可通过激活Nrf2/HO-1信号通路阻断OGD/R诱导的BV2细胞氧化应激。5、PAH可通过阻断NF-κB信号通路下调OGD/R诱导BV2细胞中NLRP3介导的炎症反应。