【摘 要】
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机体代谢产生的多余自由基可能会攻击DNA和蛋白质等分子,引发多种慢性疾病。BHT、BHA等合成类抗氧化剂具有潜在毒性。天然抗氧化肽是一种有效的替代品,已经成为目前的研究热点。抗氧化肽的制备方法很多,其中酶解法是最主要的方法之一。鸭肉含有丰富的蛋白质,但至今鸭肉源抗氧化肽的研究较少。本论文以鸭胸肉为原料,通过可控酶解技术制备强效抗氧化肽,借助超滤、凝胶过滤层析、半制备液相色谱纯化鸭肉肽,利用液相色谱
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机体代谢产生的多余自由基可能会攻击DNA和蛋白质等分子,引发多种慢性疾病。BHT、BHA等合成类抗氧化剂具有潜在毒性。天然抗氧化肽是一种有效的替代品,已经成为目前的研究热点。抗氧化肽的制备方法很多,其中酶解法是最主要的方法之一。鸭肉含有丰富的蛋白质,但至今鸭肉源抗氧化肽的研究较少。本论文以鸭胸肉为原料,通过可控酶解技术制备强效抗氧化肽,借助超滤、凝胶过滤层析、半制备液相色谱纯化鸭肉肽,利用液相色谱-串联质谱鉴定肽序列并对其进行人工合成及活性验证,最后以ROS自由基清除能力、细胞抗氧化能力CAA值、抗氧化酶活力及丙二醛含量等为指标评价肽组分在Caco-2细胞内的抗氧化能力。本文的具体研究内容和结论如下:1.鸭肉源抗氧化肽的酶解工艺研究选择低廉的蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶）为实验用酶,以DPPH自由基清除率为指标,发现中性蛋白酶的酶解产物表现最强的自由基清除率。通过单因素实验和响应曲面法（RSM）,优化中性蛋白酶的酶解条件,并结合实际情况对其进行适当修改,最后进行实验验证,发现模型可靠。最优酶解条件为:酶的用量1500 U/g、酶解时间1 h、酶解温度35℃、酶解pH 6.5,DPPH自由基清除率为69.53± 1.48%。2.鸭肉肽的分离鉴定及构效关系研究借助超滤、凝胶层析色谱和半制备型液相色谱分步纯化鸭肉酶解产物,使用Nano-LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS/MS对其进行氨基酸序列鉴定,共鉴定出11条新型的且可溯源的抗氧化肽序列。人工合成这些肽段并进行验证实验,发现肽段AGPSIVH具有最强的DPPH自由基清除能力,LLCVAV具有最强的还原力,而FLLPH和LLCVAV能有效地清除ABTS自由基。3.鸭肉肽的胞内抗氧化活性研究使用肠上皮细胞模型Caco-2细胞,利用过氧化氢（H2O2）作为氧化应激诱导剂,研究具有较强体外活性的肽组分在氧化的Caco-2细胞中的抗氧化能力。结果显示:鸭肉肽对Caco-2细胞没有造成明显的毒副作用,并能清除ROS自由基、提高抗氧化酶活性及抑制脂质过氧化。这表明鸭肉源抗氧化肽是一种较强的抗氧化应激抑制剂,能够用作功能食品的成分。
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