茉莉花香气合成相关基因JsGDS启动子的分离与活性分析

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大根香叶烯合成酶(GDS)是茉莉花(Jasminum sambac(L.)Ait)香气合成途径(MVA途径)中重要的下游酶类,其催化底物法呢基焦磷酸(FPP),生成倍半萜类物质(大根香叶烯),为探究GDS基因的表达调控机制,本研究以双瓣茉莉花为材料,提取基因组DNA,采用染色体步移技术,分离茉莉花香气合成相关基因JsGDS的5’端上游调控序列,找出启动子的顺式作用元件,预测影响JsGDS表达的外界环境因素;采用Gateway技术,构建5个含不同5’端长度的缺失植物表达载体转化拟南芥,对转基因植株进行GUS染色分析,检测启动子及其缺失片段在苗期不同生长阶段的活性,确定启动子的最短长度和组织特异性,为进一步探究茉莉花香气调控机制提供理论依据,主要研究结果如下:1.采用染色体步移技术,获得了茉莉JsGDS基因的5’端调控序列,找出了启动子的顺式作用元件:采用植物基因组DNA提取试剂盒(CTAB法),获得纯净的双瓣茉莉基因组DNA,以该DNA为模板,采用染色体步移技术,获得了1646bp的JsGDS基因的5’端调控序列,应用启动子在线分析软件Plant CARE和PLACE,找出启动子的顺式作用元件,分析结果表明,JsGDS基因的5’端调控序列中,除含植物启动子核心元件(TATA-box和CAAT-box)外,还包含与激素响应相关的元件:光响应相关元件:AE-box、AT1-box、Box-4、I-box和TCT-motif,脱落酸相关元件(ABRE)、茉莉酮酸甲酯相关元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)和赤霉素相关元件(GARE-motif),厌氧诱导相关元件(ARE)等,说明JsGDS基因的表达与光照、激素等环境因素密切相关。2.采用Gateway技术,构建了5个含不同5’端长度的缺失植物表达载体:根据JsGDS基因的5’端调控序列中顺式作用元件的分布情况,扩增含5个不同5’端长度的启动子片段,依次为JsGDS(-1646~-1)、JsGDSP1(–926~–1)、JsGDSP2(–666~–1)、JsGDSP3(–406~–1)和JsGDSP4(–206~–1),应用Gateway技术,将其融合到带有GUS报告基因的p GWB633载体上。3.利用已构建的含不同5’端长度的缺失植物表达载体转化拟南芥,对茉莉JsGDS基因启动子的活性进行分析:将上述构建好的含不同5’端长度的缺失植物表达载体转化农杆菌(GV3101),用农杆菌侵染拟南芥的花瓣,获得T0代转基因植株;再应用Basta抗性和PCR法对转基因植株进行筛选,获得T1代阳性转基因植株;对转基因T2代植株进行GUS染色,试验结果表明,T2代转基因拟南芥植株均具有GUS活性,生长7天的小苗GUS活性最强,且只在芽点上表达;转基因植株生长35d时,GUS染色结果表明,在拟南芥盛开阶段时,5个启动子片段均具有活性,JsGDS全长启动子的活性强于其它片段,JsGDSP1和JsGDSP3活性最弱,5个启动子缺失片段均表现组织特异性表达,JsGDS和JsGDSP2除在花序、果荚和腋芽中均有表达外,JsGDS还在叶片中表达,JsGDSP2还在茎生叶中表达;JsGDSP1和JsGDSP3只在腋芽中表达,JsGDSP4仅在花序和腋芽中表达。因此,JsGDS基因启动子的最短长度至少为206bp,–926~–666和–406~–206之间可能存在负调控元件,–666~–406之间可能存在与叶和果荚表达相关的关键顺式元件,JsGDSP4片段中可能存在与花器官表达相关的关键顺式元件。
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