【摘 要】
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谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）能将谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）,是谷氨酸分解代谢途径中的关键限速酶,广泛存在于自然界的细菌及动植物中。目前已有研究报道,植物GAD家族在植物的生长发育和逆境胁迫中具有重要作用,但关于OsGADs家族在水稻生长发育中作用及作用的分子遗传机理研究相关的报道数量有限。本论文通
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（编号:31760080）； 江西省自然科学基金青年基金项目（编号:20192BAB214003）； 南昌大学研究生创新专项资金项目（CX2019108）；
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谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）能将谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）,是谷氨酸分解代谢途径中的关键限速酶,广泛存在于自然界的细菌及动植物中。目前已有研究报道,植物GAD家族在植物的生长发育和逆境胁迫中具有重要作用,但关于OsGADs家族在水稻生长发育中作用及作用的分子遗传机理研究相关的报道数量有限。本论文通过生物信息学方法,分析了水稻OsGADs家族基因及其编码蛋白的主要特征特性;基于qRT-PCR法分析了OsGAD2在水稻不同组织器官中的表达模式;利用CRISPR/Cas9技术创建了OsGAD2的单基因双靶点敲除纯合突变体,发现OsGAD2敲除纯合突变能显著地影响水稻的株高、粒长和粒重等。为深入探究OsGAD2基因在水稻生长发育中的作用及其作用的分子遗传机理奠定了重要基础。主要研究结果如下:1.明确了水稻OsGADs基因家族及其编码蛋白的主要特征特性生物信息学分析结果显示,5个水稻OsGADs基因分别分布在8号、4号、3号染色体上;基因全长变幅为2300～8500 bp,外显子数量为4～7个;蛋白分子质量为54.53～57.24 k Da;等电点（p I）为5.54～7.12;亚细胞定位预测OsGAD1～OsGAD4可能定位在胞质中,OsGAD5预测可能定位在叶绿体中;但除OsGAD2外,水稻OsGADs家族其他成员存在结合Ca MBD的结合位点;水稻OsGADs家族基因的启动子中均含有多个/种与生长发育相关调控、光调控、激素调节和逆境响应等相关的顺式作用元件,暗示它们可能在水稻的生长发育和逆境适应中具有重要作用。2.揭示了OsGAD2在水稻不同组织器官中的表达模式qRT-PCR检测结果表明,在正常条件下的粳稻中花11中,OsGAD2主要在水稻幼穗及种子中高表达;其中在P2时期的幼穗中表达量最高,在随后的穗子发育中其表达量急剧降低;在水稻籽粒发育的3D和5D时期,OsGAD2的表达量较高,在水稻籽粒发育的其它时期其表达量较低。暗示OsGAD2可能在水稻穗子和种子的发育发挥重要作用。3.创建了OsGAD2的纯合敲除突变体采用CRISPR/Cas9技术和水稻遗传转化技术,成功创建了OsGAD2的T0代单基因双靶点敲除突变体,其突变率为100%;经世代分离和分子鉴定,已成功获得3种不同突变类型的OsGAD2敲除纯合突变体,突变类型分别为-3bp/+A、+T/+A、+234bp。对敲除靶点进行脱靶分析结果表明,这3种突变体均无脱靶效应,可用于后续实验。4.OsGAD2敲除纯合突变对水稻株高和籽粒性状的影响于大田种植的水稻成熟期,对水稻株高和籽粒性状进行观测分析,结果表明:OsGAD2敲除突变显著增加了水稻的株高、粒长和粒重;其中,野生型的千粒重为24.19克,3个突变体的千粒重分别为28.05克、26.14克和27.45克,与野生型相比,千粒重分别增加了15.96%、8.06%和13.48%。
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