论文部分内容阅读
目的:急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）因其高发病率、高死亡率的特点是继恶性肿瘤后人类最主要的死亡原因。近年来,AMI发病率、死亡率呈现上升趋势,且年轻人及女性发病率开始升高。AMI的传统危险因素并不能准确预测疾病发生,且目前AMI的主要诊断指标肌钙蛋白存在灵敏度高、特异度低的特点。因此AMI缺乏有效的早期预测及诊断标志物。本课题通过基础研究探索AMI发病机制中的关键调控因子,为寻找AMI新的生物标志物寻找理论依据。方法:（1）构建AMI及Sham小鼠模型,对小鼠心肌组织进行RNA测序,寻找AMI的差异表达基因及可变剪接并进行分析,分析可变剪接位点、可变剪接事件、可变剪接类型等,对差异可变剪接基因进行GO、KEGG分析及蛋白相互作用分析。挑选有代表性的目的基因及其可变剪接,用PCR方法对AMI及Sham小鼠心肌组织中的目的基因及可变剪接的表达进行检测,验证测序结果。（2）将新疆医科大学第一附属医院心脏中心收治的AMI患者纳入研究对象,将无冠状动脉病变及动脉粥样硬化的人群设为正常对照,分别收集其基线资料。24小时内采集患者及正常对照血浆及PBMC样本,24小时内检测患者及对照CK、CK-MB、肌钙蛋白I、NT-pro BNP、LDH、ALT、AST、低密度脂蛋白、甘油三酯、总胆固醇、肌酐、尿酸、血糖、CRP、PLT、D-二聚体、左室EF值。追踪采集AMI患者心梗第7天、第30天血浆标本,分别用ELISA及PCR方法检测AMI患者心肌梗死不同时间血浆及24小时内PBMC中POSTN表达水平,对研究结果进行统计学分析,并根据AMI患者及正常对照人群24小时内血浆POSTN水平绘制受试者工作曲线,评估24小时内血浆POSTN水平对AMI的诊断效能。（3）1)购买小鼠HL-1心肌细胞系,通过复苏、传代培养,测定7天细胞生长OD值,绘制生长曲线,评估细胞生长状态。通过检测不同缺氧时间（3小时、6小时、12小时、24小时）对心肌细胞生长OD值及LDH水平,确定最佳缺氧时间,构建心肌细胞缺血缺氧模型。用PCR方法检测缺血缺氧心肌细胞中POSTN及其可变剪接的表达,用Western Blot的方法检测缺血缺氧心肌细胞中POSTN蛋白表达。2)构建POSTN野生型、突变型及阴性对照过表达慢病毒（GV492-POSTN-WT、GV492-POSTN-MUT、GV492-NC）,摸索最佳病毒转染条件。分别用GV492-POSTN-WT、GV492-POSTN-MUT及GV492-NC转染HL-1心肌细胞,用PCR方法检测心肌细胞POSTN及可变剪接的表达水平,验证慢病毒是否构建成功。3)用GV492-POSTN-WT、GV492-POSTN-MUT及GV492-NC分别转染正常及缺血缺氧心肌细胞,设立不同干预条件的实验分组共8组,对干预后的心肌细胞进行细胞增殖及凋亡检测,探索POSTN及可变剪接对正常及缺血缺氧心肌细胞增殖及凋亡的影响。选择内质网应激相关凋亡蛋白,分别对8个干预组进行相关蛋白检测,探索POSTN及可变剪接影响心肌细胞凋亡的机制。结果:（1）AMI与Sham小鼠心肌组织中共检测出1367个差异表达基因,其中上调基因242个,下调基因1125个。所有检出的可变剪接事件中,非内含子保留占72.1%,内含子保留占27.9%。10种常见可变剪接类型在AMI与Sham小鼠心肌组织中水平相当,AMI小鼠心肌组织中未注释的可变剪接检出最多的为Intron R,A5SS和5p MXE 3种类型。AMI组和Sham组所有基因检出最多的AS类型均为A5SS、A3SS、Intron R。不同的是,AMI小鼠检出最多的是A5SS,而Sham小鼠检出最多的是Intron R。42个差异表达基因发生了差异可变剪接事件,其中本底表达水平最高的9个基因是COL18A1,FHL1,FN1,MYLK4,IL4RA,POSTN,RTN4,CAPG,NR4A1。42个基因GO富集分析显示:在细胞成分上主要富集在细胞膜、细胞膜的完整性及胞外区。分子功能富集在蛋白结合和金属离子结合。生物过程主要富集在细胞粘附、免疫过程及细胞分化。KEGG分析主要富集在Jak-STAT信号通路、小细胞肺癌及PI3K-Akt信号通路。FHL1、FN1、POSTN均在AMI小鼠心肌组织中低表达,POSTN可变剪接在AMI小鼠心肌组织中高表达,结果与测序结果一致。（2）AMI患者24小时内血浆及PBMC中POSTN均显著低表达。AMI患者血浆POSTN水平在24小时内最低,7天时明显升高,30天时接近正常水平。其快速上升期在7天之内,7天至30天内有缓慢上升。与正常对照相比,AMI患者血甘油三酯、CK、CK-MB、肌钙蛋白I、LDH、ALT、AST、NT-pro BNP、肌酐、D-二聚体均显著升高。AMI患者24小时内血浆POSTN水平与肌钙蛋白I、CK、CK-MB、LDH、AST、ALT、NT-pro BNP、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、左室EF值、CRP、D-二聚体、血小板、肌酐、尿酸均未表现出显著相关性。当POSTN为302.3ng/ml时,对AMI诊断的灵敏度达73%,特异度达85%。（3）缺血缺氧心肌细胞模型POSTN及POSTN蛋白表达水平降低,POSTN可变剪接表达水平升高。POSTN可促进正常及缺血缺氧心肌细胞增殖,并抑制其凋亡。POSTN抑制心肌细胞凋亡的机制可能是通过抑制内质网应激的GRP78-e IF2α-ATF4-CHOP通路发挥作用。POSTN可变剪接可抑制缺血缺氧心肌细胞凋亡,其作用机制需要进一步研究证实。结论:POSTN及其17号外显子可变剪接在AMI发病机制中具有重要作用。POSTN的低表达可能与AMI早期心肌细胞凋亡有关。POSTN可能通过抑制ERS的GRP78-e IF2α-ATF4-CHOP通路抑制AMI心肌细胞凋亡。24小时内血浆POSTN水平对AMI具有一定诊断价值。POSTN有望成为AMI新的生物标志物及潜在治疗靶点。