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土壤重金属污染是世界性的环境问题,利用根际微生物和植物联合作用对土壤重金属污染进行生物修复是本领域的一个前沿研究方向。实验室前期的研究发现一类称之为深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes,DSEs)的植物内生真菌可以显著提高矿区植物重金属耐受性,促进受重金属污染土壤的植物修复。越来越多的研究发现这类菌丝颜色较深且有横隔、并在植物根系形成微菌核的DSE普遍定殖于矿区植物根部,且表现出极强的重金属积累能力和耐受性,然而其机制却不甚清楚。重金属矿脉的形成通常都伴随着硫化物,而硫又是机体生长所必需的元素,其在机体适应重金属胁迫过程中发挥着非常重要的作用。本文以前期从云南会泽一个古老铅锌尾矿遗址上生长的孟加拉野古草(Arundinella bengalensis)根内分离的嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila,H93)为材料,在低硫、正常硫、高硫条件和镉(Cd)胁迫浓度(EC50为111.2mg/L)胁迫下培养H93,以正常硫不加镉处理为对照,探讨硫营养对H93镉耐性的影响及机制,从生理、细胞及分子水平上探讨硫在DSE应对重金属胁迫中起的作用。论文取得的主要结果如下:1、随着培养基质中硫营养水平的增加(即从2 mg/L增加到40 mg/L和600 mg/L),H93菌丝内的重金属Cd含量显著降低,而菌丝的生物量显著增加,菌丝体内总S的含量也随着硫营养的增加而增加。值得注意的是在高浓度硫(600 mg/kg)处理下H93菌丝生物量有所下降,但仍高于低硫营养培养条件下的生物量。说明适度的硫营养在缓解镉毒性和促进H93生长发育中起着重要作用。2、硫通过影响H93菌丝内抗氧化剂和抗氧化酶以及硫化物的合成来增强H93对Cd的耐性。EC50浓度Cd胁迫下,随着硫营养的增加H93菌丝体内的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和氧自由基(Oxygen free radical,OFR)水平下降,表明胞内Cd胁迫减轻,还原型谷胱甘肽(Glotathione,GSH)、金属硫蛋白(Metallothionein,MT)、植物络合肽(Phytochelatins,PCs)、非蛋白硫醇(Non-protein thiols,NPT)及总巯基化合物含量升高,即胞内与重金属离子的结合能力增强,从而增强了 H93对Cd的耐性。3、对Cd在H93菌丝亚细胞组分的分析发现,Cd主要分布在可溶性组分和细胞壁中(即重金属解毒区),细胞器中分布较少(重金属敏感区),而且在低硫营养条件下,Cd大量在细胞壁中积累,随硫营养水平的增加,细胞可溶性组分中Cd的含量也增加,这与随着硫营养增加菌丝胞内与Cd的结合能力增强的结果是一致的。对H93菌丝体内Cd不同化学形态赋存形式分析发现,Cd主要以水提取态、醋酸提取态以及氯化钠提取态为主,其中含量最高的氯化钠提取态,其次为水提取态。随着S营养增加氯化钠提取态比例上升,而氯化钠提取态主要提取果胶酸盐和蛋白质结合态的Cd。醋酸和盐酸提取态比例也与S营养呈正相关关系,与其他提取态相比,醋酸和盐酸提取态(重金属磷酸盐和草酸盐)重金属迁移活性最低,说明H93随着硫营养的增加使活性高的Cd向迁移活性低的Cd转变以减轻重金属的毒性。这些结果表明,不同硫营养可影响Cd在H93菌丝内的化学形态和亚细胞分布,从而减轻Cd的毒害,增强菌丝对Cd的耐性。4、以Cd胁迫下H93的转录组数据为基础,选择了与硫代谢及重金属胁迫相关的8个基因为研究对象,分别是编码金属硫蛋白(metallothionein,MT)、谷胱甘肽硫转移酶(GSTS-transferase,GST)、硫酸盐同化(合成和转运)(sulfate assimilation(biosynthetic process and sulfate transporter))、膜定位信号识别颗粒依赖性翻译蛋白(SRP-dependent cotranslational protein targeting to membrane)以及超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)的基因,利用荧光定量PCR技术对这些基因在不同硫营养水平上的表达情况进行初步分析,发现除了 GST和SOD的一个编码基因外,其余6个基因对重金属胁迫和硫营养水平的响应呈现不同的特征,甚至是同一蛋白家族的不同编码基因对重金属和硫营养水平的响应也不完全相同。与无Cd胁迫正常硫营养水平培养H93的对照相比,在EC50浓度Cd处理条件下,硫营养水平的升高(从40mg/L上升到600mg/L)显著提高了编码MT基因的表达,却不显著影响一个编码GST和一个SOD基因的表达,然而另一个编码GST和SOD的基因的表达却受到重金属镉的浓度和硫营养浓度的双重调控。编码SOD的基因在正常MMN培养基(30mg/LMg2+浓度)条件下表现为显著上调表达,而高Mg2+浓度处理(450mg/L)条件下,该基因显著下调表达。同时编码硫酸盐合成的基因、硫酸盐转运的基因以及硫酸盐同化过程中的膜定位信号识别颗粒依赖性翻译蛋白基因的合成也受到了硫营养水平的调控,前两个基因皆在正常硫营养水平(40 mg/L)下表达量达到最大值,但硫酸盐合成基因在高硫营养水平、高Mg2+浓度(600mg/L、450mg/L)条件下显著下调表达,而硫酸盐转运蛋白基因在正常硫、高Mg2+浓度(40 mg/L、450 mg/L)条件下表达量达到最高值。结果表明增强与硫代谢及重金属胁迫相关基因的表达是H93增强Cd耐性的重要分子机制之一。上述结果表明Cd胁迫下,不同硫营养水平对H93的Cd耐性有明显的影响,随着硫营养的增加,H93对Cd的耐性也增强,其作用过程涉及到硫代谢和重金属胁迫相关的细胞、生理和分子机制,本文对这些过程和机制进行了初步研究,为通过控制硫营养水平来增强真菌Cd耐性打下了基础。