土壤重金属污染已经成为世界性的环境问题,土壤中过量的重金属不仅影响作物的产量和品质,还可以经食物链危害人体的健康。提高植物重金属耐性能够降低由重金属污染带来的负面影响。目前,关于植物重金属耐性机制的研究主要集中在根系的限制吸收作用,根系的外排作用,有机化合物的螯合作用,抗氧化系统以及细胞壁的固定作用等方面。木质素是细胞壁的组成成分之一,由木质素单体在过氧化物酶和漆酶的催化下聚合而成,木质素的合成能够参与植物对环境胁迫的响应。在本研究中,我们重点研究了 Cu胁迫下水稻木质素合成的响应机制,并通过在拟南芥中表达水稻漆酶基因研究其在植物重金属耐性中的作用,具体结果如下。首先,我们对水稻幼苗进行了不同浓度及不同时间的Cu处理,并在转录水平和生理水平上对样品进行了分析。分析结果显示,Cu胁迫能显著增强水稻根系木质素合成途径基因的表达,根系木质素的含量也随着Cu处理浓度及时间的增加而显著升高,水稻根系伸长显著受到Cu胁迫的抑制,Cu胁迫对木质素单体组成(S/G)则没有显著影响。另一方面,Cu胁迫能够显著提高水稻幼苗根系可溶态、细胞壁离子结合态愈创木酚过氧化物酶(G-POD)和漆酶(LAC)的活性,抑制细胞壁共价结合态G-POD的活性;同时,Cu胁迫能显著提高根系细跑壁离子结合态NADH-POD的活性、H2O2和可溶性总酚的含量。以上结果表明,Cu胁迫可以通过增强木质素聚合反应来提高水稻根系中木质素积累的水平。Cu胁迫能够同时诱导水稻根系木质素和过氧化氢的积累,而过氧化氢可以作为过氧化物酶的共底物参与到木质素聚合反应中,因此我们通过施加NADPH氧化酶抑制剂(二亚苯基碘,DPI)和H2O2清除剂(二甲基硫脲,DMTU)来检验Cu胁迫诱导的H202在木质素生物合成中的作用。研究结果显示,与单独Cu处理相比,在Cu处理前添加DPI和DMTU预处理能显著减少水稻地上部和根系的干重,降低水稻根系H202的含量以及木质素的积累,下调水稻根系中部分木质素生物合成途径基因的表达;同时也能显著降低根系细胞壁离子结合态G-POD、NADH-POD和LAC的活性,促进水稻幼苗根系中的Cu向地上部转运;相反,外源H2O2处理在增加水稻根系内源H202含量的同时,能显著上调水稻根系木质素生物合成途径基因的表达,增加水稻根系木质素的含量;短时间的H2O2处理能显著提高水稻根系细胞壁G-POD、NADH-POD以及LAC的活性。以上结果表明,在水稻根系中,Cu胁迫诱导产生的H202能够参与调控木质素单体的聚合反应及木质素的积累,而这一过程可能会影响Cu从根系向地上部的转运。Cu胁迫能够显著提高水稻根系漆酶的活性,而漆酶能够和过氧化物酶一样参与木质素单体的聚合反应。我们通过施加漆酶特异抑制剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)在生理水平上初步研究了漆酶在木质素生物合成以及水稻Cu耐性中的作用。研究结果显示,在正常条件下,CTAB处理能显著降低水稻根系漆酶的活性,同时,能够显著抑制水稻幼苗干物质的积累、根系伸长以及木质素的积累,提高Cu的转运系数,而在Cu胁迫下,这些效应会进一步增强。以上结果表明,漆酶可能在水稻根系木质素积累的过程中起着重要作用。利用生物信息学的技术和手段对水稻漆酶家族基因的分类,编码蛋白质的特征、相关功能的预测以及漆酶家族基因的时空表达和非生物胁迫诱导表达模式进行了系统的分析。同时,利用定量PCR检测了 Cu、Cd胁迫下水稻根系中漆酶基因表达水平的变化。研究结果显示,水稻漆酶属于铜结合蛋白家族成员,大多数定位在分泌途径,可以分为五个亚族;水稻中31个漆酶基因分布在8条染色体上,并分布于染色体的各个部位,主要在发育早期的胚乳,生长期的根和茎中表达;同时,漆酶基因的表达受到激素、盐、干旱和重金属胁迫的诱导,其中OsLAC11和OsLAC30的表达在20 μM Cu处理12 h和100 μM Cd处理6 h后均达到最高水平。研究结果表明,水稻漆酶的催化位点序列比较保守,水稻漆酶基因家族成员的时空表达模式之间存在一定的差异;一些漆酶基因能够参与对环境胁迫的响应,其中OsLAC11和OsLAC30均为重金属(Cu和Cd)胁迫响应基因。为了进一步研究OsLAC11和OsLAC30的生物学功能,我们首先构建了OsLAC11和OsLAC30的原核表达载体,并将其转入大肠杆菌进行表达,对大肠杆菌的漆酶活性及重组蛋白的表达进行了检测。随后,构建了 OsLAC11和OsLAC30的植物过表达载体,将其转入拟南芥中进行表达,并对野生型和转基因拟南芥的木质素积累,对重金属(Cu和Cd)的耐性和吸收进行了分析。研究结果显示,转OsLAC11和OsLAC30的大肠杆菌在IPTG的诱导下均能表达出具有漆酶活性的蛋白。与野生型相比,转OsLAC11拟南芥根系木质素积累显著增加,转OsLAC30拟南芥根木质素积累变化不明显。在含Cu(50 μM)1/2 MS培养基上生长7天后,转OsLAC11拟南芥根长显著大于野生型,转OsLAC30拟南芥根长与野生型差异不显著;在含Cd(50 μM)1/2 MS培养基上生长7天后,转OsLAC11拟南芥根长与野生型差异不显著,转OsLAC30拟南芥根长显著大于野生型。在水培条件下,5 μMCu处理3天后,与野生型相比,转OsLAC11拟南芥根系Cu含量显著降低,地上部则没有显著变化;10 μM Cd处理3天后,与野生型相比,转OsLAC30拟南芥根系、地上部Cd含量均没有显著变化。以上结果表明,OsLAC11可能参与催化木质素的合成,并能够增强拟南芥Cu耐性,减少拟南芥根系对Cu的吸收;OsLAC30能够增强拟南芥Cd耐性,但不影响拟南芥对Cd的吸收。