牛初乳中乳铁蛋白分离纯化工艺及生物活性研究

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乳铁蛋白(Lf, lactoferrin)是一种用牛初乳经过硫酸铵两次沉淀,然后用乙醇沉淀得到的粗提产品再经凝胶层析柱纯化后得到的一种活性蛋白。现已经证明乳铁蛋白具有多种生物学功能,能提高肠道细胞对铁离子的吸收、具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、调节机体免疫反应等多种功能;并已广泛应用于食品、畜牧等行业。目前国内外对乳铁蛋白的研究存在的共同问题是采用的多种分离纯化方法的成本太高,使得许多研究都只能局限于实验室规模,难以实现工业化生产。本试验研究了牛初乳中乳铁蛋白的粗提和纯化的工艺条件,并对其进行了优化,对提取得到的乳铁蛋白的广谱抗菌能力及抗氧化能力进行了初步地研究,得出了以下主要研究成果:1研究了乳铁蛋白的粗提工艺,利用盐析和有机溶剂沉淀法结合的方法对牛初乳中的乳铁蛋白进行初步的分离,采用单因素试验和正交试验的方法对影响分离效果的因素进行了试验研究,得出的结论是:用pH值8.5、硫酸铵浓度80%进行盐析,然后用乙醇浓度60%进行沉淀,分离的效果较好。SDS-PAGE凝胶电泳结果表明,乳铁蛋白的纯度大约为48%,分子量大约为80600Da。2研究了乳铁蛋白的纯化工艺,利用凝胶层析柱将粗提得到的乳铁蛋白样品进行纯化,采用单因素试验和正交试验的方法对影响纯化效果的因素进行了试验研究,得出的结论是:洗脱时间为1h、进样量为7mL、流速为0.8mL/min、缓冲液pH值为7.6的条件下得到的乳铁蛋白样品纯度高达93%,分子量大约为80200Da。3研究了提取纯化得到的乳铁蛋白的广谱抗菌能力,通过测定抑菌圈的大小,初步可知牛乳铁蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌都有一定的抑菌效果;通过最小抑菌浓度的测定,得出以下结论:牛乳铁蛋白对大肠杆菌的MIC为2000μg/mL,对金黄色葡萄球菌和草芽抱杆菌的MIC为1500μg/mL,对沙门氏菌和巴氏杆菌的MIC为1250μg/mL。4研究了乳铁蛋白的抗氧化能力,通过对粗提纯化后的乳铁蛋白的总抗氧化能力、羟基自由基清除能力、超氧自由基清除能力的研究,其结果表明:该乳铁蛋白具有较强的总抗氧化能力、羟基自由基清除能力、超氧自由基清除能力。在乳铁蛋白浓度在2~6mg/mL范围时,总抗氧化能力、清除羟基自由基及超氧自由基的能力随着样品浓度的增大而增大;但其浓度在6~10mg/mL范围内时,随着样品浓度的增大,总抗氧化能力、羟基自由基清除率、超氧自由基清除率变化并不明显。
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