意义原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC,以下简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一,大多数患者确诊时已经局部晚期甚至发生远处转移,严重威胁人民群众的健康和生命。中医药抗癌疗法作为肝癌治疗的重要组成部分,可以控制病情进展,且安全性较好,能够为患者带来较好的客观疗效和生存获益。三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)是传统中药砒霜的主要有效成分,近年来大量研究结果表明三氧化二砷在治疗中晚期肝癌方面具有一定的姑息治疗作用。因此,我们初步探讨三氧化二砷对肝癌细胞的作用机制,为其更好地应用于肝癌的临床治疗提供实验依据。目的本课题以人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721为研究对象,并在此基础上构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型,主要从细胞增殖、自噬和凋亡等方面研究三氧化二砷在体内外对肝癌细胞作用的内在机制,以期为肝癌综合治疗模式提供实验依据和新的思路。方法1.MTT法检测不同浓度As2O3对肝癌HepG2细胞作用不同时间(24h、48h、72h)增殖抑制的影响。2.倒置相差显微镜观察不同浓度(OμM、5μM、10μM、15μM) As2O3作用肝癌HepG2细胞24h形态学的变化。3. Hoechst33258染色法检测不同浓度(OμM、5μM、10μM、15μM) As2O3作用肝癌HepG2细胞24h凋亡形态变化的影响。4. TUNEL法检测As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞24h凋亡形态变化的影响。5. Annexin V-FIFC/PI双染法检测As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞24h凋亡的影响。6.透射电子显微镜观察As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞24h对细胞凋亡和自噬的影响。7.免疫荧光检测As2O3 15μ作用肝癌HepG2细胞24h后自噬蛋白LC3 A/B、Beclin 1的表达情况。8. Western Blot分别检测不同浓度(OμM、5μM、10μM、15μM)As2O3作用肝癌HepG2细胞24h及As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞不同时间(0h、2h、4h、8h、12h、24h)后LC3 A/B、p62蛋白表达水平的变化。9. Western Blot分别检测不同浓度0μM、5μM、10μM、15μM)As2O3作用肝癌HepG2细胞24h及As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞不同时间(0h、2h、4h、8h、12h、24h)后P-JNK、JNK、P-p38、p38、P-Akt、Akt、P-mTOR、mTOR、Caspase-3、Caspase-7、 Caspase-8、Caspase-9、PARP、p27蛋白表达水平的变化。10. Western Blot检测PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理后P-Akt、Akt、LC2 A/B、p62蛋白表达水平的变化。11. Western Blot检测P13K抑制剂3-MA预处理后LC3 A/B、p62、Caspase-3、P-JNK、JNK、 P-p38、p38蛋白表达水平的变化。12. BALB/C裸鼠18只,右下肢腋部皮下接种人肝癌SMMC-7721细胞,建立人肝癌荷瘤裸鼠模型。13.成瘤后随机分为阴性对照(0.9%氯化钠注射液)组、As2O3低剂量[2mg/(kg·d)]组、As203高剂量[4mg/(kg·d)]组,腹腔注射0.2 mL/d,连续2周。每隔3天测量肿瘤的长径(a)和短径(b),按公式V=ab2/2计算肿瘤体积。停药后1天处死剥瘤记录,并计算抑瘤率。14.采集肿瘤组织标本,HE染色观察形态结构。15.TUNEL法检测As203对裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响。结果1.同一时间内,随着As203作用浓度升高,其对肝癌HepG2细胞的增殖抑制率逐渐增加。与对照组相比,除24h时间段的As2O3 1μM、2μM、5μM组,48h时间段的As2O3 1μM、 5μM组外,其余均有显著的统计学差异(P<0.05)；同一浓度内,As2O3 1μM、2μM组除外,随着As203作用时间延长,其对肝癌HepG2细胞增殖抑制率逐渐升高。与对照组相比,除As2O3 1μM的24h、48h时间段,As2O3 2μM、5μM的24h时间段,其余均有显著的统计学差异(P<0.05)。2.不同浓度As203作用24h后倒置相差显微镜观察肝癌HepG2细胞的形态变化,镜下可见：与Control组相比,As2O3处理组细胞生长状态不良,轮廓增强,细胞变得不规则,随着药物浓度升高,情况进一步严重,甚至出现细胞漂浮,失去原有特点。3.不同浓度As203作用肝癌HepG2细胞24h后,Hoechst33258染色结果显示：随着药物浓度升高,As2O3处理组与Control组相比,细胞核呈现致密浓染,亮蓝色荧光强度也逐渐变强。4. As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞24h后,TUNEL法检测结果显示：Control组只可见极少数绿色荧光,而As2O3 15μM组镜下观察到大量的绿色荧光的凋亡细胞。5. As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞24h后,流式细胞仪检测结果显示：与Control组相比,As2O3 15μM组早期和晚期凋亡细胞百分比显著增加。6. As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞24h后,透射电子显微镜观察可见：与Control组相比,As2O3 15μM组绒毛减少,粗面内质网颗粒减少,线粒体肿胀变形,核染色质边集,胞质内出现“空泡化”现象；部分胞浆内出现大量双层及多层膜的自噬泡结构,部分溶酶体染色加深,一些区域还出现了自噬溶酶体结构。7. As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞24h后,免疫荧光检测LC3 A/B和Beclin 1的表达情况。激光共聚焦扫描显微镜下观察可见：As2O3组中均有Beclin 1和LC3 A/B表达,与Control组相比表达量显著增多。8.不同浓度As2O3作用肝癌HepG2细胞24h后,Western Blot检测结果显示：随着药物浓度升高,LC3 A/B蛋白表达逐渐升高,p62蛋白表达逐渐降低；As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞不同时间后,随着作用时间的延长,LC3 A/B蛋白表达逐渐升高,p62蛋白表达逐渐降低。9.不同浓度As2O3作用肝癌HepG2细胞24h后,Western Blot检测结果显示：随着药物浓度升高,P-JNK、P-p38蛋白表达水平逐渐升高,Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、 Caspase-9、PARP、P-Akt、P-mTOR表达水平逐渐降低,总量JNK、p38、Akt、mTOR变化不大。As2O3 15μM作用肝癌HepG2细胞不同时间后,随着作用时间的延长,p27表达水平逐渐升高,P-Akt、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3表达水平逐渐降低,总量Akt变化不大。10. PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理后,Western Blot检测结果显示：LY294002可显著抑制Akt磷酸化,与As2O3联合处理后可明显提高LC3 A/B蛋白表达水平,减少p62蛋白表达量。11.P13K抑制剂3-MA预处理后,Western Blot检测结果显示：3-MA抑制自噬后,As2O3联合3-MA组与As2O3单独处理组相比,LC3 A/B蛋白表达水平降低,p62蛋白表达水平升高;与Control组相比,As2O3联合3-MA组Caspase-3表达水平降低,但高于As2O3单独处理组；与As2O3单独处理组相比,As2O3联合3-MA组P-JNK、P-p38蛋白表达量明显减少,总量JNK、p38变化不大。12.18只裸鼠造模成功,As2O3干预治疗2周后,生理盐水组裸鼠明显消瘦,活动能力下降；与生理盐水组相比,As2O3处理组进食和饮水等减少不明显,精神活动尚可。其中As2O3高剂量组2号裸鼠干预第10天不明原因死亡。13.As2O3对人肝癌SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤生长的影响：As2O3低剂量组和As2O3高剂量组瘤体积抑制率分别为23.24%和37.90%。与生理盐水组相比,As2O3高剂量组平均瘤体积变化值具有统计学差异(P<0.05)。14.肿瘤切片后进行HE染色,镜下观察可见：生理盐水组肿瘤组织细胞多呈团灶状分布,组织结构尚可；As2O3低剂量组细胞体积变小,部分区域肿瘤组织可见凋亡现象；A82O3高剂量组出现细胞核深染、核固缩,正常结构消失,其间见大片状坏死灶。15.As2O3对人肝癌裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响：TUNEL染色结果显示：镜下观察细胞核出现块状棕黄色或棕褐色为阳性表达,阴性对照则无结果。与生理盐水组相比,As2O3低、高剂量组阳性细胞比例增多,染色程度逐渐变深,呈棕色沉淀,多为弱阳性或阳性。结论1.As2O3在一定浓度范围内能够抑制肝癌HepG2细胞增殖,且此抑制作用具有一定的剂量和时间依赖性。2.As2O3能够诱导肝癌HepG2细胞凋亡,其机制可能与MAPK信号通路、PI3K/Akt/mTOR信号通路、caspase依赖性凋亡通路有关。3.As2O3能够诱导肝癌HepG2细胞自噬,抑制PI3K/Akt信号通路可以诱导自噬性死亡的发生。4.As2O3诱导肝癌HepG2细胞凋亡和自噬过程中存在交叉机制,抑制自噬可以抵抗细胞凋亡。5.As2O3对人肝癌SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制作用。6.As2O3体内能够促进肝癌SMMC-7721细胞发生凋亡。