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食物过敏是一种重要的过敏病症,是机体暴露于某种食物或食物成分时由特定免疫应答引起的可重复发生的不良反应。食物过敏能够导致不同程度的机体损伤,包括消化系统、呼吸系统、循环系统和皮肤的损伤,甚至可以导致致命的过敏性休克。因此,食物过敏被视为影响公众营养卫生的食品安全问题之一。随着人们对食物过敏问题的日益重视,针对食物过敏原的快速、准确的检测方法得到了发展,其中免疫学方法具有灵敏性高、特异性强的特点,能够进行定性、定量检测而成为研究热点。作为一种重要的粮食作物,大豆应用广泛,并在人类和动物营养方面起着至关重要的作用,但大豆也是八种主要致敏性食物之一,含有多种致敏蛋白,容易引发婴幼儿及幼龄动物出现过敏反应。本研究以大豆中的两种主要致敏蛋白glycinin和β-conglycinin为研究对象,在制备免疫学特性良好的兔源多克隆抗体(Polyclonal antibody,p Ab)和鼠源单克隆抗体(Monoclonal antibody,m Ab)的基础之上,研制出分别用于glycinin和β-conglycinin快速检测的双抗体夹心ELISA试剂盒和胶体金免疫层析试纸。一方面可以应用于食品标签上大豆致敏成分标注信息的快速准确监管,进一步提高大豆过敏消费者的食品安全;另一方面可以作为研究大豆致敏蛋白脱敏方法的有效工具,用于鉴定脱敏方法的可行性与有效性。本研究的主要研究结果如下:(1)利用等电点沉淀法从脱脂大豆粉中分离纯化glycinin和β-conglycinin,将glycinin和β-conglycinin分别免疫新西兰大白兔,采用颈部皮下多点注射,四次免疫之后进行心脏采血并分离血清。利用饱和硫酸铵沉淀法纯化制备glycinin兔源p Ab和β-conglycinin兔源p Ab,经ELISA方法鉴定,效价分别为1:1.024×106和1:5.12×105,并且具有良好的敏感性和较强的特异性。(2)将glycinin和β-conglycinin分别免疫6~8周龄的BALB/c小鼠,选择多克隆抗血清效价高、敏感性好的小鼠,应用细胞融合技术建立杂交瘤细胞系,经过对阳性杂交瘤的筛选,获得1株稳定分泌glycinin m Ab的杂交瘤细胞株2C3和3株稳定分泌β-conglycinin m Ab的杂交瘤细胞株1G6、7E7、8C11。通过小鼠体内诱生腹水法制备m Ab,这4株m Ab的亚型均为Ig G1型,间接ELISA测定效价分别为1:5.12×105、1:2.56×105、1:1.024×106和1:5.12×105;间接竞争ELISA测定半数抑制浓度分别为498.7 ng/m L,844.2 ng/m L、479.4 ng/m L和889.6 ng/m L;ELISA饱和法测定亲和常数分别为4.27×109 L/mol、3.29×108 L/mol、1.34×109 L/mol和3.48×108 L/mol。交叉反应试验和免疫印迹试验表明4株m Ab均具有很强的特异性。(3)基于制备的兔源p Ab和鼠源m Ab,利用双抗体夹心模式建立glycinin和β-conglycinin的ELISA检测方法。应用2C3 m Ab和glycinin兔源p Ab研制出glycinin双抗体夹心ELISA检测试剂盒,检测限为16.3 ng/m L,线性检测范围为15.625~2000 ng/m L,奶粉样品的平均添加回收率为80.5%~88.9%,变异系数小于15%;应用7E7 m Ab和β-conglycinin兔源p Ab研制出β-conglycinin双抗体夹心ELISA检测试剂盒,检测限为15.4 ng/m L,线性检测范围为15.625~2000 ng/m L,奶粉样品的平均添加回收率为83.4%~90.9%,变异系数小于15%。两种试剂盒与其他常见食物致敏蛋白无交叉反应,特异性良好,且具有很好的稳定性,能够在4℃条件下避光保存至少3个月。(4)基于胶体金免疫层析技术,利用制备的兔源p Ab和鼠源m Ab,首次成功研制出分别用于glycinin和β-conglycinin快速检测的胶体金免疫层析试纸。Glycinin试纸的目测和机读检测限分别为100 ng/m L和46.1 ng/m L;β-conglycinin试纸的目测和机读检测限分别为200 ng/m L和152.8 ng/m L。两种试纸的奶粉样品平均添加回收率和变异系数均在正常范围内,与其他常见食物致敏蛋白无交叉反应,特异性强,且重复性和稳定性良好,可以常温密封干燥保存至少3个月。