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背景:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可引起包括无症状携带、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化和肝癌的一系列肝脏疾病谱。全世界大约有3亿人已经成为HBV慢性携带者,我国的HBV感染者约为1.1亿,约有3000万的乙型肝炎患者,全国每年死于与HBV感染相关肝病约30万人。目前尚无彻底清除HBV的理想药物,因此HBV感染已经成为严重影响我国人民健康的公共卫生问题。HBV是非常容易发生变异的DNA病毒,而基因型和亚型变异是最常见的HBV基因变异形式,可以影响HBV基因型间差异超过全长8%序列,而且基因型的分布存在明显的地理分布特点和人种差异;还有YMDD变异、前C区变异、BCP变异等点突变可以影响HBV的生物学功能。因为特异性淋巴细胞表位(epitope)是特异性细胞免疫应答得以激发的主要原动力,处于免疫识别和免疫激活的核心位置。当变异位点涉及HBV表位序列时,可能会影响宿主针对HBV的免疫应答能力。因为目前HBV表位主要由欧美国家学者鉴定,这些国家的HBV基因型主要以A、D为主。以HLA-A~*0201限制性HBcAg18-27特异性CTL表位FLPSDFFPSV(C18-27V)为例,它被认为是表位研究中的经典序列,是从欧、美地区的主要流行病毒株基因型A、D中鉴定出来的;而在我国HBV基因型背景下,C18-27的结构可能发生了变化。鉴于HBV基因型和基因亚型之间的较大序列差异,鉴定适合我国病毒学背景研究的新表位,用合适的HBV表位序列探究我国HBV基因(型)变异与细胞免疫应答规律将有重要的研究意义。目的:调查在我国HBV优势基因型中,C18-27V/I变异体的分子流行病学特点和在细胞免疫学研究中的差异;通过B、C基因型特异性多肽池(pool)调查研究我国HBV感染者T淋巴细胞免疫特点,并筛选适合HBV特异性T细胞表位鉴定的调查人群;比较HBV基因型间、热点变异组间T淋巴细胞免疫功能差异。方法:1.通过GenBank中上传的30条HBV基因序列分析和本室测序的20条序列以DNASIS软件对比分析,研究C18-27V/I的分布特点;应用生物学软件分析基因B、C型的C基因序列,并构建C18-27V/I变异体的PCR-RFLP检测方法;应用生物信息学网站预测并比较C18-27V/I与HLA分子的结合力预测分值变化;2.从我室保存的全国HBV基因型调查血清库中,选择160份血清,通过自行构建的PCR-RFLP法检测,并调查C18-27V/I变异体的流行病学特点;3.在我国流行分布的C18-27I优势背景下,选取南方医院住院的57例慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞,应用四聚体染色技术、体外增殖培养技术、酶联免疫斑点试验,比较外周血中C18-271特异性淋巴细胞的频数与C18-27V特异性淋巴细胞频数的差别,以及分析两者间T淋巴细胞功能上的差异;4.检测57例慢性乙型肝炎患者临床常规指标(ALT、TBil、HBV DNA)以及HBV基因型,比较分析C18-27V/I特异性淋巴细胞频数与这些临床指标的相关关系;5.依据我国HBV基因型B、C中的特点,参考20条GenBank序列,设计针对我国HBV基因型B、C重叠多肽;并且设计混合多肽pool,以便在我国HBV基因背景下检测淋巴细胞的特异性应答反应;6.选取南方医院感染内科住院的38例HBV感染者的外周血淋巴细胞,以及10例健康对照者的外周血淋巴细胞,依据HBV感染的临床特点将患者分成HBeAg阴性慢性乙型肝炎组、HBeAg阳性慢性乙型肝炎组、HBV感染肝衰竭组、肝硬化组等,通过多肽诱导IFN-γ分泌,酶联免疫斑点实验进行检测,比较不同临床组间特异性T淋巴细胞分泌功能的差异;7.分析38例样本的酶联免疫斑点实验的结果,比较本研究设计的不同基因型多肽pool间在诱导HBV特异性淋巴细胞分泌的差异;8.检测38例HBV感染者HBV基因型,分析B、C基因型患者间特异性T淋巴细胞应答反应差异;9.检测38例HBV感染者前C区变异、BCP变异,分析变异阳性与阴性组间特异性T淋巴细胞应答反应差异;10.收集38例HBV感染者临床资料,分析临床常规指标(ALT、TBil、HBV DNA)与HBV特异性淋巴细胞功能的关系;结果:1.通过比对GenBank序列发现C18-27I在各国基因B、C型的流行株中有广泛的分布,而C18-27V则在其它基因型流行株广泛分布;2.我们成功构建了一种PCR-RFLP的方法,可以在基因B、C流行区简便快捷的筛选C18-27V/I变异体;3.通过来自全国8省市的160份血清调查,发现在我国主要流行的B、C基因型中,C18-271毒株成为主要病毒学背景,阳性率98.12%(157/160);4.C18-27V/I四聚体染色慢性乙型肝炎外周血淋巴细胞结果提示:在C18-27I病毒学背景下HLA-A2患者外周血C18-27I特异性淋巴细胞较C18-27V特异性淋巴细胞频数高(0.335±0.479%vs 0.221±0.392%),差异有统计学意义(P=0.012);5.经过C18-27V/I肽诱导后C18-27V/I四聚体及CD8双阳性细胞比诱导前明显增殖(2-10倍),其中C18-27I诱导淋巴细胞增殖能力高于C18-27V肽,并发现两肽之间在诱导增殖方面存在明显的交叉反应;6.C18-27V/I肽分别诱导12例HLA-A2阳性慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞并直接酶联免疫斑点试验检测IFN-γ分泌,两肽均未诱导出阳性斑点;7.通过序列比对,我们设计了HBV基因B、C型覆盖HBV全长的282条重叠多肽,每肽18个氨基酸,相邻多肽重叠10个氨基酸;并设计了10个多肽pool,每pool包含22-34条肽,分别区分两种HBV B/C基因型,区分HBV X、C、S和P基因区;8.将38例HBV感染者和10例健康献血员分成HBeAg阴性慢性乙型肝炎组(G1=12)、HBeAg阳性慢性乙型肝炎组(G2=11)、急性肝衰竭组(G3=5)、肝硬化(G4=8)、急性HBV感染组(G5=2)、特殊HBV标志物组(G6=4)和健康对照组(G7=6);G7组的斑点均数为(2.208±3.924 SFC),确定阳性pool的Cutoff=10 SFC;9.酶联免疫斑点试验比较各组间(G1-G7)斑点分布结果差异有统计学意义(x~2=15.277,P=0.018);在慢性HBV感染组(G1-G4)中进行比较,组间各样本总斑点数之间差异不显著(x~2=6.5,P=0.088),但阳性pool的数量差异显著,有统计学意义(x~2=9.2,P=0.027);进一步比较G1、G2组间样本的阳性pool数,差异有统计学意义(z=-2.345,P=0.019),阳性pool病例数之间的差异也有统计学的意义(x~2=5.856,P=0.016);10.HBV感染各组(G1-G5)中,有HBV DNA检测结果的36例资料,分析ALT水平与淋巴细胞分泌IFN-γ总斑点均数呈正相关关系,经非参数相关检验有统计学意义(CC=0.352,P=0.030);logDNA与淋巴细胞分泌IFN-γ总斑点数有负相关趋势,但经非参数相关分析无统计学意义(CC=-0.114,P=0.495);11.检测发现HBV基因B型(23例)比基因C型(9例)患者有较高的特异性淋巴细胞总斑点数,差异有统计学意义(z=-2.517,P=0.012);分别比较两型间代表S基因区pool总斑点数的(Sgene)和代表P基因区pool总斑点数的(Pgene)差异有统计学意义(z=-2.194,P=0.028;z=-2.479,P=0.013);而两型间代表X基因区和C基因区的斑点数差异无统计学意义(z=-1.635,P=0.102;z=-0.728,P=0.467);12.发现前C变异和BCP变异阳性组在样本总斑点数和代表C基因区的斑点数较对应的阴性组差异无统计学意义,C基因区的斑点数在变异组中有升高趋势;结论:1.C18-27I毒株是我国HBV感染者的主要病毒学背景;在此背景下,外周血C18-27I的特异性淋巴细胞频数和功能与C18-27V特异性淋巴细胞存在差异,如果引用C18-27V而不考虑病毒学背景可能出现一定的误差;2.HBV基因B型患者比基因C型患者有较高的T淋巴细胞特异性应答能力,这对于解释HBV基因B型患者HBeAg血清自然转阴率高于感染基因C型患者,以及基因B型较基因C型患者对抗病毒药物有更好应答的现象提供了细胞免疫学的重要依据;