牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）是原产于中国重要的传统观赏植物和药用植物,隶属于芍药科,以其花大、艳丽、多姿多彩而具有很高的观赏价值。花色是观赏植物必不可少的观赏性状,类黄酮是决定花色的次生代谢产物之一,它赋予了花朵丰富多彩的颜色,包括淡黄色、绯红色、红色、洋红、紫罗兰色和蓝色等。MYB-bHLH-WD40蛋白复合体调控着花青苷生物合成途径,目前对牡丹花色在转录调控方面的研究还较少。本研究选取了中原牡丹品种‘赵粉’、‘玉板白’和‘黑花魁’为试材,利用超高液相色谱技术测定不同花色牡丹花瓣中花青苷和黄酮类化合物的组成和含量。基于转录组数据信息,筛选出牡丹花青苷合成途径中的关键结构基因,以及可能参与牡丹花青苷合成调控的MYB、bHLH和WD40转录因子,探讨了MYB-bHLH-WD40蛋白复合体如何调控牡丹花青苷生物合成途径,为揭示牡丹花色形成的调控机制提供依据,也为牡丹花色改良和分子育种提供有价值的基因。主要获得了以下研究结果:1.利用超高液相色谱技术对中原牡丹品种‘赵粉’、‘玉板白’和‘黑花魁’的花青苷成分和类黄酮成分进行定性分析,结果显示白色系的‘玉板白’中未检测到任何的花青苷成分,红色系的‘赵粉’中主要花青苷组成为天竺葵素-3,5-二葡萄糖苷（Pg3G5G）和芍药素-3,5-二葡萄糖苷（Pn3G5G）,紫红色系的‘黑花魁’中检测到了5种不同的花青苷,分别为Cy3G5G,Pg3G5G,Pn3G5G,Cy3G和Pn3G。在三个品种均检测到了18种黄酮和黄酮醇苷元,推断黄酮和黄酮醇苷元的存在对白色系牡丹的呈色具有重要的作用。此外,对‘黑花魁’牡丹色素成分定量分析结果显示,Pn3G5G、Cy3G5G和Cy3G三者是整个发育过程中影响‘黑花魁’花色形成的主要色素。花青苷和类黄酮成分在‘黑花魁’硬蕾期的含量均较低,硬蕾期至显色期含量呈现显着上升,初开期至盛开期虽有上升的趋势,但整体趋于稳定,变化不大。2.采用Illumina novaseq 6000转录组测序技术对三个中原牡丹品种花瓣进行了测序和分析,经组装后共获得167702个All-unigenes,平均长度707 bp。经同源比对共有66797个Unigene（占全部Unigene的39.83%）获得注释,并对这些基因进行了NR,Swiss-Prot,KEGG,KOG等比对分析。基于筛选出来的差异基因（DEGs）,对参与花青苷合成途径中的结构基因进行qRT-PCR验证,推断出F3H、F3’H、DFR和ANS这四个基因可能是引起三个品种花色差异的关键基因,是本研究一个重要的结论。3.基于转录组测序数据,鉴定出了84个牡丹bHLH转录因子,依次命名为PsbHLH1-84,根据系统进化树的聚类情况和拟南芥对家族的划分,将牡丹的PsbHLH1-84划分为具有不同功能的31个亚家族。同时发现牡丹PsbHLH1、PsbHLH2和PsbHLH3与拟南芥中参与调控花青素和原花青素合成的IIIf类基因AtbHLH001、AtbHLH002、AtbHLH012和AtbHLH042聚为第五亚家族。同源序列比对显示,牡丹PsbHLH1、PsbHLH2和PsbHLH3转录因子含有三个保守的结构域,即MIR结构域（the MYB interaction region）,bHLH结构域和ACT-like结构域,符合bHLH转录因子的家族特征。PsbHLH1蛋白的bHLH保守域（basic域）发现含有高度保守的氨基酸残基His5-Glu9-Arg13（H-E-R）和Arg10-Arg12,分别是能结合启动子六核苷酸E-box顺式作用组件（E-box:CANNTG,variation:CACGTG）和维持DNA骨架的重要结构域。而PsbHLH2蛋白和PsbHLH3蛋白在这些位置上的残基有明显不同,PsbHLH2蛋白为Asn5-Asp9-Gly13和Arg10,PsbHLH3蛋白则为His5-Asp9-Lys13和Gly10-Arg12。荧光定量分析得出PsbHLH1、PsbHLH2和PsbHLH3转录因子的表达是先于花青苷的形成,在结构基因的上游起主要的调控作用。此外,三个转录因子均定位于细胞核中。4.基于转录组测序数据,鉴定出了123个牡丹MYB家族蛋白,其中包含60个R2R3MYB蛋白,57个MYB-relate蛋白,4个R1R2R3-MYB蛋白和2个4R-MYB蛋白,并且R1R2R3-MYB蛋白和4R-MYB蛋白是牡丹中首次被发现。对牡丹R2R3 MYB蛋白构建系统进化树,发现共划分为了S1-S25亚家族,其中S4、S6、S7亚家族的R2R3-MYB转录因子参与类黄酮的生物合成,并且具有不同的功能。对S4、S6、S7亚家族所涉及的转录因子进行荧光定量,分析发现S6亚家族的PsMYB1基因是调控花青苷合成的关键基因,在着色品种中的表达量较高。对PsMYB1和PsMYB2蛋白进行了同源序列比对分析发现,两个蛋白在N端MYB结构域的R3结构域中,均含有与bHLH蛋白互作的高度保守基序[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R motif。此外,两个蛋白在C端也均拥有一个与双子叶植物R2R3-MYBs相同的花青苷合成相关的特征基序[K/R]P[Q/R]P[Q/R]。根据这两个结构域进一步推断这两个基因可能参与牡丹花瓣花青苷的合成。此外,亚细胞定位试验表明这两个MYB转录因子均定位在细胞核中。5.基于前期测序所得牡丹转录组数据,筛选出了38个牡丹WD40转录因子,依次命名为PsWD40-1-PsWD40-38。通过和其他植物中已经证明参与花青苷合成的WD40转录因子构建系统进化树,鉴定出PsWD40-1和PsWD40-2蛋白可能参与牡丹花瓣花青苷的生物合成。同源序列比对分析发现,牡丹PsWD40-1和PsWD40-2蛋白,都含有4个高度保守的WD基序,基序中最后两个氨基酸残基（WD,FD,LD和WE）在不同物种间的保守性较高。亚细胞定位试验表明两个WD40转录因子均是定位在细胞核。6.采用了酵母双杂（Y2H）技术和荧光双分子互补技术（Bi FC）来验证牡丹中存在MYB-bHLH-WD40这一蛋白复合体,PsMYB1和PsWD40-1蛋白可以与PsbHLH1互作,而PsMYB1则不能与PsWD40-1互作,是与苹果中一致的MBW复合体调控模式。通过染色体步移技术,克隆牡丹花青苷合成途径中八个关键结构基因（PsCHS、PsCHI、PsF3H、PsF3’H、PsFLS、PsFNS、PsDFR和PsANS）的启动子,又根据启动子分析软件（Plant CARE）的预测结果可知,MYB转录因子结合元件Myb-binding site（MBS）和MYB recognition site（MRE）,bHLH转录因子识别元件E-box元件（CANNTG）或G-box（CACGTG）元件等存在于多个结构基因的启动子区。采用酵母单杂技术、双荧光素酶试验和活体成像试验得出结论,PsMYB1和PsbHLH1不仅能够结合到PsDFR和PsANS基因的启动子区域,激活它们的表达,也能和PsWD40-1组成MYB-bHLH-WD40复合体增强PsDFR和PsANS的启动子活性,但对于其他几个结构基因则无明显的调节作用。