链格孢菌强产毒菌株的筛选和限制性内切酶介导整合(REMI)转化的产毒诱变

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分离自紫茎泽兰的链格孢菌产生的真菌毒素具有开发生物源除草剂的潜力。菌株产毒能力大小直接影响到发酵产物的毒素含量和杀草效果,强产毒能力菌株的筛选对于产业化十分必要。本文通过链格孢菌不同菌株间与产毒相关的生物学特性进行比较研究,目的是筛选强产毒菌株。进一步,进行链格孢菌原生质体制备试验,探索最适合的体系和条件,之后,进行限制性内切酶介导整合(REMI)原生质体转化试验,摸索REMI转化的方法和条件,目的是获得产毒减弱REMI突变株,为产毒相关基因的克隆提供研究材料。分离自不同地区的链格孢菌菌株的产毒量不同,在继代培养的过程中也会发生产毒突变。通过液体培养产毒实验,从现有的21个链格孢菌菌株中筛选出产毒最强的菌株NEW。并对这21个链格孢菌菌株的部分生物学特性进行了比较研究,通过SAS统计软件分析了各生物学特性间的相关性。发现链格孢菌的致病力、产毒量和产孢量呈显著正相关。利用这一相关性,可以通过筛选致病力增强突变株来筛选强产毒突变株。紫外诱变是微生物育种最常用的方法之一。通过紫外照射对链格孢菌的产毒特性进行了诱变,获得了紫外照射时间对链格孢菌分生孢子的致死曲线,但最后并没有筛选到产毒增强的突变体。还需进一步的筛选或找出提高菌株产毒量的替代途径。以筛选出的产毒量最大的菌株NEW为供试菌株,研究了菌龄、酶系统、酶解时间、酶解温度及稳渗剂对链格孢菌原生质体制备的影响,探索出了适合链格孢菌菌原生质体制备的体系和条件:菌丝块在PD液体培养基中培养20h后收集菌丝体,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,1%Lysing Enzyme、1%Drislase和1%Snailase3种酶溶液混合使用,30℃酶解3h。利用该方法获得的原生质体数量和再生率都符合转化的要求。对REMI的转化体系进行了摸索,确定了限制性内切酶的用量,质粒的形式及用量,成功地获得了链格孢菌的REMI转化子。从获得的转化子中筛选出四个致病力减弱突变株NEW001、NEW021、NEW061和NEW073。通过HPLC检测发现四个突变株的产毒量都有所下降,其中突变株NEW001的产毒量不足野生型菌株NEW的五十分之一,是克隆产毒相关基因的很好突变材料。对四个产毒减弱突变株致病力、产毒量、产孢量、孢子形态、菌落生长速率等生物学特性与野生菌株NEW进行了比较分析,相关性分析再次验证了产毒量、产孢量与致病力之间的正相关关系,为致病机理的研究提供了思路。PCR扩增验证了质粒pSH75插入了病原菌基因组中,获得的四个突变体,尤其是NEW001可用于下一步的基因克隆工作。
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