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研究背景抑郁症已经严重影响到人类的生存质量。2017年2月23日,世界卫生组织(WHO)网站发布:全球抑郁症发病率占总人口的4.3%,已经达到3.22亿;2005-2015年间,患者数量增加了 18.4%;我国抑郁障碍患病率为4.2%,总伤残损失健康生命年(YLD)为8,981,401人年。抑郁症的发病机理较复杂,涉及多系统的功能紊乱,与社会-心理-生理密切相关,其发病机制仍存在许多未知领域。与抑郁症关系密切的信号转导通路---JNK(c-Jun N terminal kinase,JNK)信号通路,由于外界应激刺激和/或细胞因子的作用,能够激活机体JNK信号转导通路,JNK通路的激活可引起海马脑神经细胞的凋亡。其特异性阻断剂SP600125能够选择性抑制JNK,对JNK的阻断具有高度专一性。有研究结果显示,SP600125与电针和氟西汀两种治疗方法对大鼠强迫游泳急性应激状态的影响具有协同作用,在阻断剂条件下,对慢性应激模型大鼠的针刺治疗机制将于本研究中进一步探讨。研究目的本研究旨在通过对抑郁症的临床与实验研究现状的分析和探讨,阐述阻断剂条件下针刺与氟西汀对CUMS大鼠JNK信号转导通路的作用机制。采用侧脑室注射方法,对比观察阻断剂SP600125通过不同给药方式的异同;通过与前期研究的比较,观察实验中各因子在蛋白水平、基因水平以及在不同脑区关键因子分布的形态学变化,探讨针刺对JNK信号转导通路发挥的效应,以期为临床提供有价值的实验数据。研究方法动物分组:清洁级SD大鼠,适应性喂养后,随机分为8组:空白组、模型组、模型+针刺组、模型+氟西汀组,模型+DMSO组、模型+阻断剂组、模型+针刺+阻断剂组、模型+氟西汀+阻断剂组(n=9)。造模方法:孤养结合公认的CUMS模型大鼠---7种不可预知刺激方法(断食12h,断水24h,水平震荡30min,断食24h,昼夜颠倒24h,夹尾3min,束缚2h)连续刺激21天,平均每种方法各应用3次。干预方法:除空白对照组、模型组、模型+针刺组、模型+氟西汀组外,其余4组均行侧脑室手术,并埋置套管,术后恢复1周(前3天每日腹腔注射青霉素抗感染)。空白对照组不给予任何干预,自由饮食水;模型组:每日随机选取1种应激刺激方法,1次/日;模型+DMSO组:造模前1/2h,侧脑室注射溶剂DMSO 10ul/日;模型+SP600125组:应激前1/2h,侧脑室注射SP600125溶液10ul/日;模型+针刺组:应激前1h,针刺百会、印堂和足三里,20min/日;模型+针刺+SP600125组:应激前1h给予针刺,应激前1/2h,侧脑室注射SP600125 10ul/日;模型+氟西汀组:应激前1h,以10ml/kg灌胃给药,1次/日;模型+氟西汀+SP600125组:应激前1h给予氟西汀灌胃,应激前1/2h,侧脑室注射SP600125 10ul/日.检测指标与方法:体重及行为学共4次(实验前1天,造模第7天,第14天,第21天);ELISA 法检测模型大鼠海马组织中 Caspase-3、HSP70、JNK、p-MKK4、p-MKK7蛋白表达的含量变化;血清中Caspase-3和HSP70蛋白表达的含量变化;Western Blot法检测模型大鼠海马组织中JNK和p-JNK蛋白表达的含量变化;实时荧光定量PCR法检测模型大鼠海马组织中MKK4、MKK7、JNK基因水平的含量变化;免疫组化法观测模型大鼠海马组织的JNK和c-Jun分布的形态学变化。研究结果1.体重及行为学结果:实验前各组大鼠体重及行为学检测不存在显著差异,造模后模型各组大鼠行为学的组间差异说明了造模成功。2.ELISA 结果2.1 Caspase-3是诱导细胞凋亡的关键因子海马与正常组比较,模型+针刺+SP组升高有极显著差异(P<0.01);与模型组比较,模型+氟西汀+SP组升高有显著差异(P<0.05),模型+针刺+SP组升高有极显著差异(P<0.01);与模型+针刺组比较,模型+针刺+SP组升高有显著差异(P<0.05);与模型+氟西汀组比较,模型+针刺+SP组升高有显著差异(P<0.05)。血清与模型+针刺组比较,模型+氟西汀+SP组升高有显著差别(P<0.05),其他各组无明显组间差异。2.2 HSP70是应激刺激反应因子海马与正常组比较,模型+针刺组、模型+针刺+SP组降低有极显著差异(P<0.01);与模型组比较,模型+针刺组、模型+针刺+SP组降低有极显著差异(P<0.01);与模型+针刺组比较,正常组、模型组、模型+SP、模型+氟西汀组升高有极显著差异(P<0.01);与模型+氟西汀组比较,模型+针刺组、模型+针刺+SP组降低有极显著差异(P<0.01)。血清与正常组比较,模型+氟西汀组降低有显著差异(P<0.05);与模型+氟西汀组比较,正常组、模型+SP组升高有显著差异(P<0.05)。2.3 JNK是信号通路中的关键因子海马与模型+针刺组比较,模型+SP、模型+氟西汀、模型+氟西汀+SP组减少有极显著差异(P<0.01);与模型+氟西汀组比较,模型+针刺组增加有极显著差异(P<0.01)。2.4 p-MKK4是JNK信号通路的上游关键因子海马组间数据显著性=0.699>0.05,说明组间不存在显著差异。2.5 p-MKK7是JNK信号通路的上游关键因子海马与正常组比较,模型组、模型+针刺+SP组降低有显著差异(P<0.05);与模型组比较,正常组升高有显著差异(P<0.05)。3.Western Blot 结果3.1 JNK是信号通路中的关键因子海马各组间无明显差别(P>0.05)。3.2 p-JNK是JNK的激活形式(即磷酸化的JNK)海马与正常组比较,模型组、模型+D组升高有极显著差异(P<0.01),模型+氟西汀组升高有显著差异(P<0.05);与模型组比较,正常组降低有极显著差异(P<0.01),模型+氟西汀+SP、模型+针刺+SP组降低有显著差异(P<0.05);与模型+氟西汀组比较,正常组降低有显著差异(P<0.05)。4.Rt-PCR 结果4.1 MKK4是信号通路的上游关键因子海马与正常组比较,模型组、模型+SP、模型+D、模型+氟西汀组均升高有极显著差异(P<0.01);与模型组比较,正常组、模型+氟西汀+SP、模型+针刺组、模型+针刺+SP组均降低有极显著差异(P<0.01),模型+SP、模型+氟西汀组降低有显著差异(P<0.05);与模型+针刺组比较,模型组、模型+D组升高有极显著差异(P<0.01);与模型+氟西汀组比较,正常组降低有极显著差异(P<0.01),模型组升高有显著差异(P<0.05)。4.2 MKK7是信号通路的上游关键因子海马与正常组比较,模型组、模型+D组均升高有极显著差异(P<0.01);与模型组比较,正常组、模型+SP、模型+氟西汀、模型+氟西汀+SP、模型+针刺组、模型+针刺+SP组均降低有极显著差异(P<0.01);与模型+针刺组比较,模型组升高有极显著差异(P<0.01);与模型+氟西汀组比较,模型组升高有极显著差异(P<0.01)。4.3 JNK是信号通路中的关键因子海马与正常组比较,模型组、模型+D、模型+氟西汀、模型+针刺组均升高有极显著差异(P<0.01),模型+SP组升高有显著差异(P<0.05);与模型组比较,正常组、模型+氟西汀+SP、模型+针刺+SP组降低有极显著差异(P<0.01);与模型+针刺组比较,正常组降低有极显著差异(P<0.01),模型+氟西汀+SP、模型+针刺+SP组均降低有显著差异(P<0.05);与模型+氟西汀组比较,正常组降低有极显著差异(P<0.01)。5.免疫组化结果5.1 JNK是信号通路中的关键因子海马CA1区与模型+氟西汀组比较,模型+D组升高有显著差异(P<0.05),模型+针刺+SP组有极显著差异(P<0.01);海马CA3区与模型+针刺组比较,模型+D组有显著差异(P<0.05);与模型+氟西汀组比较,模型+D组升高有极显著差异(P<0.01)。5.2 c-Jun是信号通路中关键下游因子海马CA1区与正常组比较,模型+氟西汀组升高有极显著差异(P<0.01);海马CA3区各组间无显著差异(P>0.05)。结论1.慢性温和不可预知性应激大鼠抑郁模型建立成功;2.阻断剂SP600125能够特异性阻断针刺对JNK信号转导通路(JMK、p-JNK、MKK4、MKK7、Caspase-3)等关键蛋白和mRNA的调节,对治疗有协同作用;3.针刺可通过抑制海马内JNK信号通路激活、减少海马CA1区、CA3区神经元凋亡发挥抗抑郁作用;4.针刺可通过外周血与海马内JNK信号转导通路共同作用实现抗抑郁的作用。