肾细胞癌是最来源于肾脏的最常见的恶性肿瘤，约占到成人所有恶性肿瘤的2~3%。近年来，其发病率和死亡率逐年升高，其中年青患者的发病率和死亡率升高尤其明显。肾透明细胞癌是肾细胞癌中最常见的亚型，其约占肾细胞癌 75~80%。手术治疗是肾细胞癌主要的并且最有效的治疗方式。然而，由于缺乏早期检测和判断预后的标志物，约25~30%的患者在确诊时就已经发生了转移。另外有20~40%的接受了根治性肾切除术的患者会发生远处转移，并且预后较差。因此，阐明肾透明细胞癌发生发展的分子机制，找到其早期诊断的分子标志物及新的临床治疗靶点显得尤为重要。　　LncRNA是一类转录本超过200个核苷酸并且缺乏功能性开放阅读框的RNA，其不具备编码蛋白质的能力。到目前为止，大量的研究表明，许多lncRNA参与了肿瘤的发生与发展。它们在肿瘤的发生发展过程中可以发挥癌基因或抑癌基因的功能，并且可能被应用为肿瘤诊断或判定预后的分子标志物及肿瘤治疗的新靶点。　　LncRNA PVT1定位于人类染色体8q24。大量的研究表明，其在许多肿瘤，如肝细胞癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等中高表达，并同这些肿瘤的发生和预后相关。通过对TCGA数据库的分析提示，在所有肿瘤中，PVT1在肾透明细胞癌中表达量最高，并同肾透明细胞癌患者的总体生存期呈负相关。以上结果提示PVT1在肾透明细胞癌的发生、发展中可能发挥重要的作用。目前关于PVT1同肾透明细胞癌的相关研究较少，因此PVT1在肾透明细胞癌的发生、发展中发挥什么样的生物学功能以及其作用机制值得我们进一步研究。　　目的：　　LncRNA PVT1在肾透明细胞癌中生物学功能及分子机制尚不明确，本研究拟探讨PVT1在肾透明细胞癌发生、发展中的作用及分子机制。　　方 法：　　第一部分：LncRNA PVT1在肾透明细胞癌中的表达及临床意义　　我们共收集了 55 对在我院泌尿外科行根治性肾切除术的肾透明细胞癌患者的癌组织和临近正常肾脏组织。所收集的标本通过 qRT-PCR 检测 PVT1 的表达情况。从TCGA数据库(http://cancergenome.nih.gov/)下载PVT1在透明细胞癌的表达数据，用于分析PVT1在肾透明细胞癌中的表达及其同肾透明细胞癌TNM 分期、组织学分级及总体生存期之间的关系。　　第二部分：LncRNA PVT1在肾癌细胞中的功能研究　　1.通过siRNA干扰技术敲低PVT1在肾癌细胞株ACHN和786-O中的表达水平。通过CCK-8法检测细胞的增殖，使用平板克隆实验检测细胞的克隆形成情况，借助流式细胞法检测细胞的凋亡情况。　　2.通过裸鼠荷瘤实验验证敲低PVT1在体内对裸鼠移植瘤生长的影响。通过免疫组化方法检测移植瘤中Ki67的表达情况。　　第三部分：LncRNA PVT1抑制肾癌细胞凋亡的机制研究　　1.通过siRNA干扰技术敲低PVT1在肾癌细胞株ACHN和786-O中的表达水平。应用qRT-PCR检测Mcl-1 mRNA的表达，Western blot法检测Mcl-1及Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达。　　2.体外回复实验进一步明确Mcl-1在PVT1抑制肾细胞癌凋亡中的作用。通过平板克隆实验检测细胞的克隆形成情况，通过流式细胞法检测细胞的凋亡。应用Western blot法检测Mcl-1及Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达。　　3.回复实验进一步明确Mcl-1在PVT1促进裸鼠肿瘤生长中的作用。并通过免疫组化方法检测移植瘤中Ki67的表达情况。通过Western blot法检测移植瘤中Mcl-1及Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达。　　第四部分：LncRNA PVT1调控Mcl-1表达的机制研究　　1.通过双荧光素酶报告基因实验确定PVT1对Mcl-1基因启动子转录活性的影响。并通过RNA半衰期实验确定PVT1对Mcl-1 mRNA稳定性的影响。　　2.通过生物信息学筛选出同 PVT1有潜在结合位点，并能够直接靶向 Mcl-1 的microRNA。通过双荧光素酶报告基因实验验证PVT1同这些microRNA是否有有效的结合位点，及其在PVT1增强Mcl-1的稳定性中发挥的作用。　　结果：　　1.相对于癌旁正常组织，有47例（85.45%）肾透明细胞癌患者肿瘤组织中PVT1呈高表达。通过对TCGA数据库中72例成对的数据进行分析发现，有70（97.2%）例肿瘤组织中PVT1呈高表达。在对从TCGA收集所有的数据（534例肿瘤组织和72例临近正常组织）进行分析同样证实PVT1在肿瘤组织中高表达，并且PVT1的高表达同更高的TNM分期和组织学分级以及更差的总体生存相关。　　2.通过siRNA技术能够下调PVT1在肾癌细胞株ACHN和786-O中的表达。干扰PVT1的表达后能够抑制ACHN和786-O的增殖能力和克隆形成能力并促进其凋亡。裸鼠成瘤实验提示敲低PVT1的表达能够抑制肿瘤的生长。　　3.qRT-PCR及Western blot实验提示敲低PVT1可抑制Mcl-1 mRNA及蛋白的表达，Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的表达。过表达Mcl-1能够补救敲低PVT1引起的克隆形成能力下降，部分回复干扰PVT1引起的凋亡增加，并且能够部分回复敲低PVT1引起的Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的上调。裸鼠成瘤实验提示，过表达Mcl-1能够部分补救敲低PVT1对肿瘤生长的抑制作用。　　4.PVT1可以通过增强Mcl-1 mRNA的稳定性而不是增加其转录活性上调Mcl-1的表达。我们通过生物信息学分析提示PVT1同miR-29b-3p/ miR-30C-5p/ miR-106a-5p有潜在的结合位点，并可直接靶向 Mcl-1。但进一步研究提示 PVT1 不能通过竞争性结合miR-29b-3p/ miR-30C-5p/ miR-106a-5p来增强Mcl-1 mRNA的稳定性。　　结 论：　　PVT1在肾透明细胞癌中高表达，并同更高的TNM分期和组织学分级以及更差的总体生存相关。PVT1可通过增强Mcl-1 mRNA的稳定性来抑制肾癌细胞的凋亡。PVT1可能成为诊断肾透明细胞癌及判定其预后的潜在的分子标志物。“PVT1/Mcl-1”信号通路可能成为肾透明细胞癌的一个潜在的治疗靶点。