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目的:将系统药理学方法引入中药寒热药性理论研究,并通过整合整体实验及分子生物学实验,对多层次多角度的研究结果进行处理分析,挖掘寒热药性的分子基础,为进一步阐明寒热药性的科学内涵提供新的研究方法和研究途径。方法:一、中药寒热药性的系统药理学研究1.1寒热药性中药的选择通过以下三个原则(临床上经常使用的药物;疗效确切并有相关书籍及文献支持,己有相关研究或报道证实药性)进行筛选,最终筛选出10种寒性中药及10种热性中药。10种寒性药物分别是黄柏、苦参、龙胆、黄连、黄芩、葛根、鱼腥草、栀子、白芍、大黄;10种热性药物分别是当归、三七、肉桂、附子、麻黄、吴茱萸、高良姜、白芷、胡椒、姜黄。1.2成分数据库的构建及活性成分筛选查询TcmSP及其他多个数据库,收集寒热中药中含有的全部化合物,在统一标准化后构建成分数据库。然后采用不同计算模型对化合物进行预测,以OB、DL和HL三个指标筛选出其中的活性成分。1.3潜在靶点预测采用SysDT药物-靶点预测模型,预测所有活性成分的潜在靶点,并整合SEA、STITCH、TTD及HIT等数据库中靶点的信息,最后使用UniProt数据库对全部潜在靶点进行统一标准化。1.4成分-靶点网络的构建及拓扑分析通过Cytoscape软件分别构建寒热中药的成分-靶点网络,并通过Network Analyzer插件对网络进行分析,输出拓扑分析的结果。1.5关键靶点筛选通过点度中心性算法筛选出寒热中药的成分-靶点网络中的关键靶点。在此基础上,结合三种中心性算法的网络分析结果,对这些关键靶点进行进一步的评价与分析,寻找其中最能体现寒热药性的靶标。1.6疾病关联度分析收集TcmSP中所有和关键靶点有关的疾病信息,然后采用ICD 10编码对疾病信息重新编排分类,获得每类疾病的累计出现次数。1.7 GO分析及KEGG分析基于GO和KEGG数据库,使用ClueGO插件对关键靶点进行生物过程及代谢通路的富集分析。基于以上结果,选取特定靶点进行整体实验和分子生物学实验验证。二、寒性中药关键靶点的实验验证第一节解热作用研究通过对正常小鼠背部注射酵母混悬液建立小鼠酵母致热模型,选取系统药理学部分所研究的十种寒性中药作为实验药物,并设立高、低剂量组,观察该模型小鼠灌胃不同寒性中药后6h内的体温变化,从而研究寒性中药的解热作用,最后通过SPSS软件进行数据的分析及处理。第二节基因表达水平研究采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠的下丘脑中PTGS2的基因表达量,并通过SPSS软件进行数据的分析及处理。第三节蛋白表达水平研究采用Western Blot法检测各组小鼠的下丘脑中PTGS2的蛋白表达量,并通过Image J和SPSS软件进行条带的处理及数据的分析。结果:一、系统药理学研究结果(1)10种寒性中药共含有134个活性成分,10种热性中药共含有249个活性成分,其中每味药物的活性成分数与其总成分数的比值均在10～20%之间。同时,有多个活性成分被不止一味中药所含有。(2)寒性中药成分-靶点网络中有20个关键靶点,其中最重要的靶点是PTGS2、PTGS1、SCN5A;热性中药成分-靶点网络中有36个关键靶点,其中最重要的靶点GABRA1、PTGS2、PTGS21。(3)10种寒性中药的潜在作用疾病共123个,其中具有ICD 10编号的有120个,分为14大类。其中最主要的三种疾病类别分别是肿瘤、循环系统疾病以及神经系统疾病,寒性中药对于前列腺癌、乳腺癌等癌症、心血管疾病和癫痫症显示出一定的应用价值;10种热性中药的潜在作用疾病共137个,其中具有ICD 10编号的有126个,分为13大类,其中最主要的三种疾病类别分别是肿瘤、神经系统疾病、精神和行为障碍,热性中药对于阿兹海默症、疼痛、认知障碍、焦虑症、帕金森症等精神类疾病方面显示出潜在的治疗作用。(4)寒性中药的主要生物过程分别是正向调节环化酶活性、调节肌肉收缩、调节平滑肌收缩、母孕期妊娠过程;其主要代谢通路分别是雌激素信号通路、脂肪细胞脂解作用的调节、唾液分泌。热性中药的主要生物过程分别是突触传递的负调控、γ-氨基丁酸信号传导途径、单胺运输、调节平滑肌收缩。主要代谢通路分别是神经活性的配体-受体相互作用、酪氨酸代谢、味觉传导及唾液分泌。二、实验验证结果第一节解热作用研究结果体温检测结果表明,小鼠背部注射酵母混悬液后会产生发热反应,能量代谢增强,体温显著增加。大多数寒性中药能减弱酵母致热小鼠的发热反应,降低能量代谢及体温。同时寒性中药与降温效果之间存在一定的剂量依赖性,降温效果随剂量增加而增强,如黄柏、苦参、龙胆、黄连、栀子等。但黄芩、葛根、鱼腥草不仅不能降低酵母致热小鼠体温,还会增强能量代谢,体温持续升高。第二节基因表达水平研究结果实时荧光定量PCR法检测表明,正常小鼠背部注射酵母混悬液后,下丘脑中/TGS2基因表达显著增加;与模型组进行比较,寒性中药可降低酵母致热小鼠下丘脑中PTTG2基因表达量,10种寒性中药中有9种灌胃给药后可不同程度降低PTGS2基因表达。第三节蛋白表达水平研究结果Western Blot法检测表明,正常小鼠背部注射酵母混悬液后,下丘脑中PTGS2蛋白表达量明显增加,当对酵母致热小鼠灌胃一定剂量的寒性中药后,大多数给药组的PTGS2蛋白表达量均有明显下降。结论:本研究基于系统药理研究模式,通过数据收集、网络构建、拓扑分析寻找寒热中药的活性成分、关键靶点和潜在疾病,并发现寒热中药的主要代谢通路。在此基础上整合整体实验与分子生物学实验,结果表明,通过调控PTGS2靶点,进而减弱发热反应、降低机体体温与能量代谢,可能是中药展现其寒性药性的重要分子机制之一。此项研究为揭示寒热药性的实质提供了重要的参考依据,也为进一步阐明该理论探索出一条新的研究途径。