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目的:近年来,碳青霉烯类耐药的肠杆菌科(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE)开始出现并迅速传播,以碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)传播最为广泛,尤其是高毒力高耐药菌株(CR-hvKP),给全人类的健康造成了严重威胁。而产酸克雷伯菌虽然临床分离率低,却往往在重症患者中造成严重危害。因此,深入了解其分子耐药机制及流行病学特征,对于临床感染的治疗与防控具有重要意义。首先,本文将围绕我国六个代表性地区的CRE菌株进行分子流行病学研究,并重点分析CRKP的分子耐药和毒力情况;其次,本文将展开碳青霉烯类耐药的产酸克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiellla oxytoca,CRKO)的相关研究。从而更深入地了解中国CRE,尤其是克雷伯菌属的分子耐药特征和流行病学现状,为临床CRE感染的治疗和防控提供一定的理论基础。方法:一、中国多中心CRE临床菌株的耐药分子流行病学分析1、菌种鉴定和药物敏感性实验:收集2018年北京、成都、广州、昆明、苏州和银川六个地区的临床CRE分离株,利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)和Phoenix-100(BD)全自动微生物分析仪进行菌种鉴定及药物敏感性实验。2、碳青霉烯酶基因检测:通过PCR扩增的方法对碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaoXA-48)进行分子检测,并对阳性结果进一步测序鉴定。3、肺炎克雷伯菌分子检测:利用多重PCR技术对肺炎克雷伯菌的ST分型(ST11、ST258、ST23、ST65/375、ST86),荚膜血清型(wzyk1、wzyK2、wzyKL64、wzyKI.47)和毒力相关基因(rmpA、rmpA2、iroN、iutA)进行检测。二、碳青霉烯类耐药的产酸克雷伯菌多中心分子流行病学研究1、菌种鉴定和药物敏感性实验:收集2015年7月～2018年6月成都、昆明、苏州和银川四个地区CRKO分离株,菌种鉴定和药物敏感性实验方法同一.1。2、碳青霉烯酶基因检测:方法同一.2。3、质粒接合转移试验:通过供受体菌共培养的方法进行质粒接合转移,再通过PCR筛选出阳性接合子。4、脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE)实验:通过 PFGE 技术分析菌株间的同源性。5、质粒S1-PFGE和Southern blot验证实验:进一步鉴定碳青霉烯酶基因所整合的质粒位置。6、质粒序列分析:提取代表性质粒进行序列测定和结果分析。三、中国产NDM-5的ST258型肺炎克雷伯菌的相关研究1、菌株收集和药物敏感性实验:收集同一患者体内分离出的产NDM-5的ST258型肺炎克雷伯菌(Kp2573),碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌(Kp2588)和碳青霉烯耐药的大肠埃希菌(Ec2551)。使用VITEK2系统检测其对多种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。2、碳青霉烯酶基因和序列分型(ST)检测:方法同一.2和一.3。3、质粒接合转移试验:通过接合转移获得大肠埃希菌Ec2551和肺炎克雷伯菌Kp2573中含有耐药基因的质粒接合子,方法同二.3。4、PFGE和质粒S1-PFGE:对分离株的同源性和质粒携带情况进行比较分析,方法同二.4。5、基因组和质粒二代测序(Next-generation sequencing,NGS):对 Ec2551、Kp2573和Kp2588的全基因组以及Ec2551和Kp2573中含有blaNDM-5的质粒进行NGS测序分析。结果:一、中国多中心CRE临床菌株的耐药分子流行病学分析1、本研究共收集到404株多中心CRE菌株,肺炎克雷伯菌检出率最高,大肠埃希菌次之。耐药基因以blaKPC和blaNDM分布最广。2、CRKP主要的克隆复合群为ST11,其中KL47和KL64是两种主要的荚膜血清型且地区间分布差异显著。部分CRKP还携带有一种或多种毒力基因,苏州地区毒力基因携带率最高。二、碳青霉烯类耐药的产酸克雷伯菌多中心分子流行病学研究1、本研究共收集到13个CRKO临床分离株,菌株间同源性差异较大,碳青霉烯酶基因包括blarNDM,blaKPC和blaIMP,其中,blaIMP主要在在苏州地区检出。2、blaNDM是CRKO分离株中最常见的碳青霉烯酶基因,其所整合的质粒大小各异,以～78kb的IncX3质粒和～170kb的IncC质粒流行较广。三、中国产NDM-5的ST258型肺炎克雷伯菌的相关研究1、肺炎克雷伯菌Kp2573和Kp2588菌株间100%同源,碳青霉烯类耐药的Kp2573和Ec2551中有一相同大小的质粒,而碳青霉烯敏感菌株Kp2588不含该质粒。2、二代测序结果进一步显示Kp2573和Kp2588核心单核苷酸多态性仅为单个核苷酸差异,Ec2551和Kp2573中携带完全相同的blaNDM-5和IncX3质粒,提示碳青霉烯耐药的Kp2573有可能由碳青霉烯敏感菌株Kp2588从Ec2551中获得blaNDM-5而形成。3、中国ST258菌株与全球流行的ST258菌株从共同的祖先菌株进化而来,但中国ST258菌株具有不同的进化史。结论:1、碳青霉烯酶基因在CRE不同种属间分布各异;除银川外,ST11是CRKP的主要克隆复合群,其中,KL47和KL64是两种主要的荚膜血清型且地区间分布差异显著;苏州CRKP菌株多同时携带毒力基因和耐药基因。2、CRKO菌株携带以blaNDM为主的多种耐药基因,blaIMP主要于苏州地区检出;菌株间同源性差异较大,呈散发性流行。3、中国产NDM-5的ST258型肺炎克雷伯菌可能是由碳青霉烯敏感的ST258菌株获得含有blaNDM-5的IncX3质粒而形成的,与全球其他ST258菌株从共同的祖先菌株进化而来,但具有不同的进化史。