胰腺癌治疗的效果令人失望,由于肿瘤转移和术后复发等原因,胰腺癌5年生存率低于4％.近些年来,各种手术方式的改良及化疗、放疗方案的改进但收效甚微,因此寻求新的、有效的治疗方法是基础研究者和临床医生共同努力的方向.肿瘤基因治疗的研究和发展,为胰腺癌的治疗开辟了新途径,但几乎所有的肿瘤基因治疗载体均难以转导所有肿瘤的细胞,尤其是在体内,因此人们试图赋予治疗基因以"旁观者效应",从而使未转导的肿瘤细胞也得以被杀灭.用131Ⅰ治疗分化型甲状腺癌病人已获得了很好疗效,是核素靶向内照射治疗肿瘤最成功的典范.钠/碘同向转运体(Sodium Iodide Symporter,NIS)丰要表达于甲状腺滤泡细胞基底外侧膜,其具有逆浓度主动摄取血浆中131Ⅰ的功能.目前多个研究已经利用转基因技术使不表达或低表达NIS的非甲状腺恶性肿瘤细胞表达NIS蛋白,同时发现肿瘤细胞的低摄碘能力与NIS合成的量及NIS是否能正确锚着密切相关.由于131Ⅰ在细胞或病灶内停留的时间很短,达不到治疗剂量,故提高NIS基因转染率和延长131Ⅰ的有效半衰期成为这一研究急待解决的关键问题. 复制缺陷型腺病毒基因载体具有较好的安全性和较高的转染效率,但因其缺乏靶向性,而在体内的应用受限制.研究表明MUC1在乳腺癌、胰腺癌等少数几种癌细胞表面呈异常高表达,而在正常组织极低表达或不表达,MUC1启动子在转录水平调控基因表达,具有较高的组织和细胞特异性,MUC1启动子能调控治疗基因在MUC1阳性的肿瘤细胞内靶向表达.为此,本课题采用了复制缺陷型腺病毒作为基因载体,构建了含MUC1启动子和人NIS基因的重组腺病毒载体,结合了腺病毒的高转染效能和MUC1启动子特异性驱动功能把人NIS转染到胰腺癌细胞特异性表达,再结合131Ⅰ发射高能β粒子杀伤功能,以实现对胰腺癌内放射治疗的作用.本研究共分为如下两个部分: 第一章重组腺病毒载体的构建第一节 hNIS基因克隆及其功能研究研究目的克隆人的钠/碘同向转运体(hNIS)基因可编码序列,并构建重组真核表达质粒pDC316-MCMV/hNIS,以研究hNIS在非甲状腺肿瘤细胞内的功能表达,为进一步体内行hNIS基因转染结合放射治疗肿瘤奠定基础. 方法： 利用逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)从毒性弥漫性甲状腺肿(又称Grayes病)病人的甲状腺组织中扩增得到NIS的可编码区基因,并克隆到T载体,测序后亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒pDC316载体上,获得重组真核表达质粒载体pDC316-MCMV/hNIS.采用脂质体转染的方法把pDC316-MCMV/hNIS重组质粒(实验组)或pDC316空质粒(对照组)分别导入到胰腺癌细胞株CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和卵巢癌细胞株SK-OV-3细胞,转染后48h采用RT-PCR方法检测转染细胞内的hNIS mRNA水平,转染后第2、3、4分别检测肿瘤细胞对心125I的吸收功能. 结果： 序列分析证实克隆片段与文献报道的hNIS基因cDNA序列完全一致.实验组转染后48h,在CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞及SK-OV-3细胞内均能检测到hNIS mRNA高水平表达,对照组基本无hNIS mRNA表达.转染后第3天细胞吸碘达到高峰,实验组CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和SK-OV-3细胞对125I的吸收量分别比对照组高24倍、17倍和13倍. 结论： 从Graves病人的甲状腺组织中克隆的hNIS基因转染肿瘤细胞后,能使肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能,为进一步运用放射性核素体内靶向治疗非甲状腺肿瘤奠定了基础. 第二节 MUC1启动子的克隆及其功能研究研究目的克隆人Mucin 1(MUC1)粘蛋白的启动子序列,并研究其驱动hNIS基因在胰腺癌细胞内的靶向性表达功能. 方法： 利用巢式PCR方法从人胰腺癌细胞株CAPAN-Ⅱ细胞中扩增出MUC1启动子.采用基因重组方法构建质粒pDC316-MUC1/hNIS.采用脂质体转染的方法把pDC316-MUC1/hNIS导入到MUC1阳性的人胰腺癌细胞株CAPAN-Ⅱ、PANC-1和MUC1阴性的人宫颈癌细胞株Hela,转染后48h采用RT-PCR方法及免疫组化方法检测转染细胞内的hNIS mRNA水平和蛋白表达,转染48h后检测肿瘤细胞内NIS对125碘吸收功能. 结果： 扩增的MUC1启动子核心调控区序列与参考序列一致.重组pDC316-MUC1/hNIS转染后48h,hNIS蛋白在CAPAN-Ⅱ、PANC-1细胞阳性表达,而在Hela细胞内不表达.pDC316-MUC1/hNIS转染后仅在CAPAN-Ⅱ、PANC-1细胞内检测到高水平吸碘,分别是pDC316-MUC1转染组的7和12倍. 结论： 0.8kb的MUC1启动子能驱动NIS基因在MUC1阳性的肿瘤细胞内靶向功能表达,为进一步在体内运用放射碘靶向治疗胰腺癌奠定了基础. 第三节　重组腺病毒载体的包装、鉴定及扩增研究 　　目的：构建复制缺陷型重组腺病毒载体作为治疗基因的靶向性表达载体. 方法： 采用双质粒脂质体共转染方法构建复制缺陷型腺病毒Ad/MUC1/hNIS,PCR方法鉴定包装的重组病毒;TCID50检测重组病毒的感染滴度. 结果： 包装RAd包含了目的基因,经扩增、纯化后,检测重组病毒Ad. MUC1、Ad.MUC1/hNIS及Ad. MCMV/hNIS的感染滴度分别为1.5×109PFU/ml、2.5×109PFU/ml及2.0×109PFU/ml结论AdMaxTM包装系统能成功构建出高感染滴度的重组腺病毒,能满足进一步的体内外实验需要. 第二章体内外实验研究研究 　　目的: 重组腺病毒介导hNIS靶向转染胰腺癌后,评估其吸收125Ⅰ后的显像能力及结合131Ⅰ后的治疗胰腺癌的效果. 方法: Ad/MUC1/hNIS体外感染细胞,通过免疫荧光染色方法及细胞125Ⅰ的吸收试验检测hNIS在细胞的靶向表达及吸碘功能.构建鼠Capan-2胰腺癌模型,瘤内注射病毒后,结合放射碘,γ相机系统获取转染肿瘤清晰的图像及定量数据,并观察对移植瘤生长的抑制作用. 结果: hNIS仅在MUC1阳性的CAPAN-2和SW1990细胞的胞膜表达,且有高的125Ⅰ吸收能力,分别较对照组提高20.5和13倍.125Ⅰ显像研究表明,注射125Ⅰ后1至24h,Ad/MUC1/hNIS感染的Capan-2胰腺癌移植瘤的肿瘤影像清晰可见,而对照组Ad/MUC1感染的肿瘤不显像;结合131Ⅰ治疗能抑制胰腺癌移植瘤生长,肿瘤体积减小到原来的83％. 结论: 腺病毒介导的hNIS基因能在MUC1阳性的胰腺癌细胞靶向表达,结合125Ⅰ后能使肿瘤显像,采用131Ⅰ治疗后能抑制胰腺癌的生长. 本研究主要结论: 1. 本研究通过增强基因靶向转染提高胰腺癌内放射治疗效果,为胰腺癌的综合治疗提供的新的方法和思路. 2. 克隆的MUC1启动子核心调控序列能驱动目的基因在MUC1阳性的肿瘤细胞内靶向表达,减少了治疗基因引起的对正常细胞的损害. 3. 从Graves病人的甲状腺组织中克隆的hNIS基因转染肿瘤细胞后,能使非甲状腺的肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能,为进一步运用放射性核素体内治疗非甲状腺肿瘤奠定了基础. 4. 复制缺陷型腺病毒介导的hNIS能高效地转染肿瘤细胞,能使hNIS在肿瘤细胞内高表达,从而提高了肿瘤细胞其对放射碘的吸收能力.