当前我国农业生产每年因投放大量化肥和农药,严重影响了农业可持续发展。有效施用根际有益菌是减少以上问题的重要措施之一。近年来,芽孢杆菌与木霉菌作为根际有益菌在生物防治和根际促生方面效果良好,已成为研究微生物植物益生机理的模式菌种。基因组测序技术的发展与成熟,深刻影响了生命科学领域的研究模式,传统对微生物标靶基因的研究,已经转变为对全基因组信息的深度解析与挖掘,从而为实验研究提供数据基础。本研究对实验室分离保存的三株具有植物促生和对土传病原菌有拮抗作用的芽孢杆菌进行了全基因组测序和注释,在此基础上,收集了基因组数据库中另外28株解淀粉和枯草芽孢杆菌的基因组信息,并根据来源将这31株芽孢杆菌分为两类:植物相关研究单元(Plant-Associated,PA,分离自植物根际或植物体)和植物非相关研究单元(non-Plant-Associated,nPA,工业酶制剂发酵菌株或实验室研究模式菌株),通过比较基因组和进化基因组分析,比较了这两组芽孢杆菌的基因组异同,探索了这两类芽孢杆菌在进化过程中的基因组动态演化规律,为深入理解根际有益菌的根际适应进化机制提供了基础数据。本研究还建立了木霉基因组自动化注释平台,并利用该平台分析注释了本实验室分离保存并广泛应用于生产的一株生防菌Trichodermaguizhouense NJAU 4742,分析比较了该菌与其他木霉菌株的基因组特性。具体研究结果如下:1.为了充分了解解淀粉芽孢杆菌SQR9、NJN-6和枯草芽孢杆菌HJ5的植物益生相关的分子遗传背景,对这三株菌的全基因组进行了测序与注释分析。结果显示,它们的染色体都为单一闭合环状结构,并都无质粒存在。SQR9、NJN-6与HJ5的基因组全长分别为4.12 Mb、4.05 Mb和4.01 Mb,各包含基因4,078、3,894和3,917个。SQR9是本实验室研究PGPR菌株在根际生态行为及作用机制的主要菌种,本研究针对该菌进行了全面的比较分析:与解淀粉芽孢杆菌FZB42、DSM7T、YAU B9601-Y2和枯草芽孢杆菌168的核心基因组共包含3,014个直系同源基因,泛基因组共包含5,643个直系同源基因,其中SQR9特有的基因有309个。利用Island Finder和SeqWord的预测工具显示,SQR9共包含11个基因岛,其中第三号基因岛(GI-03)是SQR9所特有的,与某种未知的聚酮类化合物合成相关。此外,SQR9全基因组7.9%的序列与拮抗物质合成有关。以FZB42为参照,分析并整理了SQR9基因组中与植物多糖降解、细菌运动与趋化、次级拮抗物质产生(主要为抗生素类物质,如脂肽类抗生素和聚酮类抗生素)以及植物促生等相关的基因和基因簇等信息。最后,综合所有分析的结果,绘制了该菌的基因组圈图和主要代谢通路图谱,并搭建了可供远程访问的基因组浏览器。2.为了明确具有植物促生能力的枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌在根际适应进化过程中的基因组演化过程和相关的功能基因,从NCBI下载得到16个解淀粉芽孢杆菌基因组和12个枯草芽孢杆菌基因组,结合SQR9、NJN-6和HJ5共计31个基因组。经过基因组比较、系统发育分析和动态进化等分析手段,获得结果如下:(1)种族系统发育分析与层次聚类分析共同显示,31株芽孢杆菌中,分离自植物根际的菌株在进化关系上较其他菌株更为相近,这一点在枯草芽抱杆菌和解淀粉芽孢杆菌的进化分歧表现一致。由此可见,这些菌株在长期的进化过程中,都受到了根际环境的影响而表现出相同的进化趋势。(2)根据系统发育分析的结果,将31株菌分为植物相关组和植物非相关组,随后比较了这两组菌核心基因组的差异,结果显示:与植物相关的菌株,其核心基因组拥有更多与中间代谢和次生代谢产物合成相关的基因。这些基因在植物相关的菌株中呈现富集状态,与菌株利用植物分泌的各种底物和合成抗生素的能力有关,为提高菌株在根际的适应性和竞争能力。更进一步的分析也指出,植物多糖利用和抗生素合成是促使植物相关菌株在根际适应中最关键的两样特征,同时也是区分这两组菌的分水岭。(3)利用分析工具AnGST对枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在早期种族分化中的进化事件进行研究,发现无论是解淀粉芽孢杆菌还是枯草芽孢杆菌在进化成为与植物相关的芽孢杆菌时,都以水平基因转移的方式从环境中获得了大量与代谢、转录/信号转导和次级代谢合成等有关基因,而这些基因对细菌在根际中的存活和竞争力具有重要影响作用。(4)以上结果表明芽孢杆菌菌株在植物根际中的适应能力是多次通过水平基因转移的方式,从环境中获得功能基因。本研究同时也指出菌株在根际的竞争能力也不是单纯凭借一两个基因就能拥有的,而是整个系统动态的与根际环境的基因发生交换从而更新自身基因组后获得的。3.由于真菌基因组的高可塑性与多样性,导致基因组的结构注释准确率较低。为了提高木霉基因组注释准确性和可靠性,本研究对已有真菌基因组的注释方法进行了优化整合,最终构建了木霉基因组注释平台trichoCODE。trichoCODE的工作流程简述如下:阶段1,基因训练集制备,将所有可用的证据(同源蛋白集、初始基因预测集和转录组数据)制作成高质量的基因训练集;阶段2,利用训练集,对基因预测软件Augustus和SNAP进行训练和基因预测;阶段3,使用EVM工具整合所有的基因预测结果和基因证据,得到一致的基因模型;阶段4,预测结果更新,利用转录组数据对基因模型进行更新,添加可变剪接亚型和UTRs。对比了不同注释平台对已有木霉基因组注释的结果以及利用trichoCODE对新测序的近瑞氏木霉基因组进行了注释,结果表明trichoCODE的注释结果非常可靠。4.Trichoderma guizhouense NJAU 4742是一株重要的拮抗多种植物病原真菌的生防木霉。为了对该菌全部的遗传信息进行深入的认识和了解,为今后改造NJAU4742成为新型生防制剂提供分子依据。本研究对该菌的基因组进行了测序,随后利用开发完成的trichoCODE注释平台对该菌基因组进行了结构注释。基因组分析的结果显示,该菌基因组大小为38.9 Mb,共编码11,297个蛋白。系统发育分析显示NJAU 4742与绿木霉亲缘关系最近,都属于重寄生营养方式。与其他木霉基因组的比较分析显示,该菌相对拥有较丰富的天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等蛋白酶。此外,该菌与绿木霉一样拥有丰富的次级代谢产物,而其中PKS基因的数量和类型多于其他木霉。