【摘 要】
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细胞的凋亡和自噬反应有利于维持细胞数量和功能稳态。NH3诱导的细胞凋亡和自噬广泛参与细胞功能的调节。NH3作为奶牛舍内的有害气体之一,通过呼吸和皮肤黏膜刺激等对奶牛健康造成影响。乳腺细胞的增殖、凋亡以及自噬对于泌乳动物功能的正常发挥起着重要作用。PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活或抑制影响着细胞的增殖、凋亡和自噬,本文旨在探讨NH3是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路参与奶牛乳腺上皮细
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细胞的凋亡和自噬反应有利于维持细胞数量和功能稳态。NH3诱导的细胞凋亡和自噬广泛参与细胞功能的调节。NH3作为奶牛舍内的有害气体之一,通过呼吸和皮肤黏膜刺激等对奶牛健康造成影响。乳腺细胞的增殖、凋亡以及自噬对于泌乳动物功能的正常发挥起着重要作用。PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活或抑制影响着细胞的增殖、凋亡和自噬,本文旨在探讨NH3是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路参与奶牛乳腺上皮细胞的凋亡与自噬活动。NH4Cl常用作细胞水平研究中NH3的供体,以MAC-T细胞为研究对象,利用MTT和CCK-8方法检测NH4Cl对细胞增殖的影响;RT-PCR、Western blot、Annexin V FITC/PI 法、MDC 法、TUNEL 法、透射电镜等方法研究NH4Cl对MAC-T细胞增殖、炎性反应、凋亡及自噬的影响;利用PI3K或mTOR通路的抑制剂与NH4Cl共处理MAC-T细胞,评价炎性、凋亡和自噬信号的变化,揭示NH4Cl调控MAC-T细胞凋亡和自噬的分子机制。结果如下:NH4Cl对细胞增殖和炎性反应的影响:MTT和CCK-8法结果表明,4 mM NH4Cl处理MAC-T细胞12 h,能显著降低细胞活力,抑制细胞增殖,后续试验选用4 mM NH4Cl处理MAC-T细胞。NH4Cl上调MAC-T细胞IL-6、IL8、TNF-α mRNA表达,及IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表达。提示4 mM NH4Cl诱导MAC-T细胞发生了炎性反应。NH4Cl对细胞凋亡和自噬的影响:Annexin V FITC/PI结果显示,NH4Cl增加凋亡MAC-T细胞数目;透射电镜和MDC结果发现,NH4Cl处理后,细胞内自噬溶酶体和自噬泡数量明显增多;凋亡和自噬分子结果表明,NH4Cl升高Bax、Caspase-3、LC3 B mRNA水平,降低Bcl-2和p62 mRNA水平,同时Bax、Caspase-3、LC3II/LC3I比值、Beclin 1蛋白表达升高,p62蛋白表达降低。提示NH4Cl促进MAC-T细胞发生凋亡和自噬反应。PI3K/mTOR信号抑制剂对细胞凋亡和自噬的影响:PI3K或mTOR抑制剂与NH4Cl共处理细胞后,NH4Cl引起的凋亡细胞数目明显减少;促凋亡因子Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均显著下降,抗凋亡因子Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平均显著升高。自噬因子LC3 B和p62 mRNA表达增高,LC311/I蛋白比值、Beclin 1蛋白表达显著降低,p62蛋白表达显著上升。提示PI3K/Akt/mTOR通路在NH4Cl诱导的MAC-T细胞凋亡和自噬反应中有一定的作用。
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