白藜芦醇作为一种天然的二苯乙烯衍生物,具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、防治心血管疾病、抗炎、调节雌激素等多种药理作用,引起了许多国内外学者的关注,近年来有关白藜芦醇的及其衍生物的研究文章越来越多。白藜芦醇作为一种功能性营养品,具有非常广阔的市场前景。因此,如何开发一种高效的商业化白藜芦醇合成方法成为了研究热点。代谢工程改造微生物生产白藜芦醇作为一种新兴的生产方式,有望大幅提高白藜芦醇的产量。然而,目前微生物生产白藜芦醇大多使用昂贵的底物,如对香豆酸、芳香族氨基酸等,成本较高难以工业化。本论文利用代谢工程改造大肠杆菌,引入了合成白藜芦醇所必需的基因,并优化了前体物质的供给,提高发酵液中白藜芦醇的含量。本论文的主要结论如下:(1)代谢工程技术改造大肠杆菌,为了实现白藜芦醇的异源合成,首先将来源于深红酵母(Rhodotorula glutinis)的TAL基因、香芹菜(Petroselinum crispum)的4CL基因和葡萄(Vitis vinifera)的STS基因转化入E.coli BL21(DE3)内进行表达,构建了重组表达质粒pACYC-TAL-4CL和pRSF-STS。在以葡萄糖为底物进行发酵生产后,得到了0.23 mg L-1的白藜芦醇的产量,表明合成白藜芦醇的3个关键基因均能在大肠杆菌中异源表达成功。为了能够以葡萄糖为底物生产白藜芦醇,优化了葡萄糖到芳香族氨基酸的代谢途径,将编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶的aroF基因和编码抗反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶pheAfbr基因转入大肠杆菌进行表达,构建了重组表达质粒pCDF-aroF-pheAfbr,增加了葡萄糖到芳香族氨基酸的通路,提高了合成白藜芦醇所需前体物质的含量。同时为了增加白藜芦醇合成过程中丙二酰辅酶A的供给,优化了丙二酰辅酶A代谢途径,将三叶草根瘤菌丙二酰辅酶A途径中的丙二酸合成酶matB和丙二酸载体蛋白matC基因转入大肠杆菌进行表达,构建了重组表达质粒pET-matB-matC,最终得到了一株含有四个质粒的,以葡萄糖为底物的白藜芦醇生产菌株。同样以葡萄糖为底物进行发酵培养后,取发酵液进行LCMS-IT-TOF检测白藜芦醇。结果显示,途径的优化使白藜芦醇的产量达到了3.2 mg·L-1,相比未优化的菌株提高了11.9倍。(2)以一株苯丙氨酸高产菌株E.coli WSH-Z06(酪氨酸缺陷型)为出发菌株,通过传代丢失消除了带有aroF基因和pheAfbr基因的质粒pAP-B03,并利用CRISPR-Cas9系统敲除了大肠杆菌基因组上的pheA基因,降低了大肠杆菌内葡萄糖到苯丙氨酸的通路;通过表达一个抗反馈抑制的tyrAfbr基因,构建了温度诱导型pAP-tyr Afbr表达质粒,强化了大肠杆菌内葡萄糖到酪氨酸的通路。同时利用CRISPR-Cas9系统,将白藜芦醇合成的必须基因TAL、4CL、STS整合至E.coli WSH-Z06基因组上,构建了一株强化了酪氨酸合成的白藜芦醇生产菌株E.coli RES-03。在以葡萄糖为底物进行发酵培养后,取发酵液进行LCMS-IT-TOF检测白藜芦醇。结果显示,强化了酪氨酸途径的基因组整合菌株白藜芦醇的产量达到了71.6 mg·L-1,相比全质粒体系的基因工程菌产量提高了20.3倍。且该菌株相比采用Duet-1系列菌株构建的工程菌,有着不需要添加价格昂贵又有毒性的IPTG进行诱导的优势。(3)对不同温度(25℃、30℃、37℃和42℃,不同pH条件(3.0、5.0、7.0、9.0和11.0),不同培养基(水、蛋白胨水溶液、酵母提取物水溶液、LB培养基和M9培养基),以及是否存在大肠杆菌条件下白藜芦醇的降解过程分别进行了研究,发现较高的温度、碱性的pH条件,以及培养基中蛋白胨的存在,均会导致白藜芦醇降解速率的加快,造成白藜芦醇产物的损失;而在低温、酸性及不含蛋白胨的条件下白藜芦醇稳定性较高,为白藜芦醇发酵条件的优化提供了方向。通过在培养基中添加E.coli BL21(DE3)发现,大肠杆菌的生长不会增加白藜芦醇的降解速率,证明了利用代谢工程改造大肠杆菌生产白藜芦醇的可行性。测定并计算了不同温度下白藜芦醇的降解动力学参数,白藜芦醇在p H7.0时不同温度下的降解过程符合一级动力学方程,温度对白藜芦醇降解速率的影响遵循阿累尼乌斯方程:logkobs=24.896-9360.8(1/T)(r2=0.99)。同时使用LCMS-IT-TOF对白藜芦醇生产过程中的副产物进行了分析,初步确定了其主要副产物的成分为白藜芦醇二聚体以及氧化白藜芦醇。