功能性低聚糖(Functionaloligosaccharide,Oligo),是一类具有特定生理功能和生物活性的小分子寡糖,能选择性促进人体内的Bifidobacteria和Lactobacilli的增殖,维护肠道微生态平衡,促进宿主健康。我国启动了OLIGO项目,倡导在公众食品中添加Oligo以调节居民的膳食结构,改善公众营养健康,减少社会公共卫生支出。糖苷酶是酶法合成Oligo的关键酶,自然界广泛分布,且不同来源的酶具有不同的特性,适于不同的工业应用。　　 本实验室选育的AspergillusnigerM-1菌株细胞产生一种具有高转苷专一性的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase),使细胞能更为有效地合成Oligo。在发酵木薯淀粉时,该菌株合成这种主要存在细胞内的糖苷酶,其最优的产酶条件包括33℃、初始pH6.5、孢子悬液接入量6％。在此条件下,细胞干重与α-glucosidase活力在40-72hrs间同步增加,在72hrs达到酶活力的高峰;底物α-甲基葡萄糖苷在低浓度时诱导酶的产生,在8.0mmol/L以上时抑制酶的合成。经过(NH4)2SO4沉淀、DEAE-cellulose52柱、DEAE-SepharoseCL-6B柱、SephadexG-100柱的分离,在SDS-PAGE电泳胶上得到单一的蛋白条带,α-glucosidase活性组分被纯化145倍,回收率19％,比活力为6385.47U/mg。纯酶单一肽链,无亚基;经SDS-PAGE电泳、HPLC分子排阻色谱、SephadexG-100柱分离估算的分子量范围为110kDa-120kDa,为糖蛋白;等电点PI处于5.17-5.31范围内,单一PI值;N-端含有N-Ser-Val-Pro-Gly-Thr-Glu-Tyr-Va-Val-序列;在0.02mol/L醋酸钠缓冲液(Sodiumacetatebuffer,SAB,pH6.0)中,酶的最佳反应温度50℃,在60℃以下稳定;最佳反应pH6.0,在pH5.0-7.0之间比较稳定;具有键位专一性,主要水解底物的仅α-1,4-键;对α-甲基葡萄糖苷的Vmax=3.10×10-2mol/(L·min),Km=4.32mmol/L;纯酶不能利用纯麦芽糖,但能利用饴糖水溶液发生转苷反应。1mmol/L的Ca2+和Mg2+促进酶水解α-甲基葡萄糖苷的活力,而Fe2+、cu2+、Pb2+、Ag+明显抑制酶的水解活力;p-CMB、MCA、EDC·HCl、ME、n-BSI、ACAC可以不同程度抑制酶活力,推测酶活性的维持与Cys、Asp或Glu、His残基,以及至少部分二硫键有关。　　 在生长稳定期初期收获M-1的菌体,提取总RNA,逆转录为cDNA,经过PCR扩增和表达克隆方法,从9个重组质粒上获得糖苷酶保守区段序列,经3-FullRACE、5-FullRACE、数据库检索和PCR扩增,获得的目标ORF序列全长3127bp,cDNA全长2958bp;BLAST结果显示,所得cDNA序列与A.oryzae的agdA、A.flavusNRRL3357的agdA具有99％的相似性,与A.nigerCBS513.88的agRlU、A.niger的aglA的相似性为72％。该cDNA被命名为agdM,并与表达载体pSE380连接,在Ecoli菌株中表达,其中,在BL21(DE3)中表达产物最多,约为细胞可溶性蛋白的14.2％;产物在SDS-PAGE电泳胶上为一分子量约120kDa的蛋白,不含有亚基;重组蛋白的粗酶液能水解α-甲基葡萄糖苷产生葡萄糖,活力最高达到19.62U/mL,在饴糖稀释液中能够生成与出发菌A.nigerM-1不同的转苷反应产物。飞行质谱显示,重组蛋白的PI值为5.23,肽链特征与A.oryzae的agdA基因产物相似,属于糖苷水解酶31家族(Glycosylhydrolasefamily,GH-31)。结果表明,A.nigerM-1的胞内α-glucosidase是以前未被研究和发表的新酶蛋白。　　 以中等聚合度的PVA-124为基础,制备多种水不溶性凝胶固定化A.nigerM-1细胞。其中,由10％PVA-10％细胞-微量gelatin的组合在经过5次彻底冷冻和温和地局部解冻的循环(-20℃冷冻24hrs后在室温下解冻30min,再冷冻),可以使细胞的固定化得率接近100％,PVA胶体具有较高的强度,固定化效果好,所形成的稳定大孔结构胶体颗粒在使用过程中能较长时间维持多孔结构。实验中首次发现在生长稳定期收集的A.niger新鲜细胞,表现出促进PVA胶体稳定的特性,具有类似线状填充物的作用。固定化后,细胞催化α-甲基葡萄糖苷水解的Km值从游离状态的20.50mmol/L下降为11.88mmol/L,Vmax值从1.71μmolglucose/(L·min)上升至2.84μmolglucose/(L·min),,说明凝胶的形成限制了底物和产物的扩散;胶体中的细胞具有更好的温度稳定性,反应的最佳温度上升到60℃;在pH=7.0-9.0和pH=3.0-5.0条件下酶活力保持更好。固定化细胞产生的有效异麦芽糖(Isomaltooligosaccharides,IMO)组分(异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖)的总和为54.11％,略少于游离菌丝的57.3％水平,产生较少的葡萄糖、潘糖、异麦芽糖,在反应的大部分时间里,体系含有的主要有效IMO组分是异麦芽糖。　　 采用了本论文创新发展的8-MOP-UVA-LiCl方法对M-1菌株进行诱变选育。为首次将该方法应用于工业Aspergillus菌株,该方法缩短UV照射时间约50％,大幅度减少在LiCl培养基上形成的菌落数量。在100个菌落中得到了4株产酶量比出发菌株升高100％以上的菌株,其中,突变子CU-1产生接近2倍于出发菌株的糖苷酶,产酶能力遗传稳定,细胞对底物浓度的依赖程度下降,能在含15％麦芽糖的饴糖稀释液中有效合成IMO,表现出更强的转苷能力。　　 开发了高浓度木薯淀粉发酵生产低聚异麦芽糖的工艺。在CU-1发酵实验中,细胞逐步降解培养基中的木薯淀粉,生成大量含有α-1,6-糖苷键的分枝低聚糖,提供了IMO合成所需的有效糖苷供体和糖苷受体。在发酵的72hrs附近,发酵体系的pH下降到约5.0,发酵液总糖消耗放缓,糖苷酶积累量达到较高水平;在72hrs-96hrs间,体系维持pH约5.0,适宜糖苷酶的积累,高浓度的糖苷供体和受体则促使酶持续将大部分糖类转化成为IMO产物;在96hrs附近,糖苷酶活力达到峰值,非还原糖接近最大值88％,还原糖接近最低值约12％,总糖趋近最小值。这一工艺方法在不提高反应温度、不预制高浓度麦芽糖底物的条件下,实现了在水相体系中有效启动和维持转苷反应,延长高比例有效IMO产物的维持时间,工艺适用于长时间深层发酵生产高含量IMO,具有产业适应能力。