水霉拮抗菌拮抗活性及其机理研究

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水霉病(saprolegniasis)是由卵菌纲(Oomycetes)中的水霉属(Saprolegnia)的一些真菌引起的水生动物常见病害,水霉感染会造成鱼体死亡、鱼卵孵化率降低等危害,其中寄生水霉(Saprolegnia parasitica)孢子萌发快,侵袭能力强,对淡水鱼类危害尤其严重,每年对淡水水产养殖业造成巨大损失。不管是在医学、农业还是养殖领域中,真菌感染一直被视为难以控制的微生物病害。长期以来对于水霉病的防治都是依赖孔雀石绿——一种能有效广谱杀菌的化学染料,但是由于其对人体具有高致癌、高致畸、高残留等危害,已经在世界范围内被禁止用于食品级水产养殖。应用化学药物、抗生素、疫苗以及中草药等进行防治水霉感染的研究,发现也有各种缺点和不足。因而对于水霉病的防治至今仍缺乏安全有效的方法。以生物拮抗为核心的生物防治方法具有绿色、环保、安全、高效的优点,近年来水产领域水霉病生物防治研究进展较快,代表着水霉病防控研究的主流方向。随着国家食品质量安全水平的不断提高,替代性新药药源越来越少,而且新筛选药物是否存在潜在安全隐患也未为可知。随着基因工程技术的日益成熟与普及,开展以基因工程为基础的生物防治或生态防治,成为今后病害防治研究的优选方向。芽孢杆菌属(Bacillus)以其非致病性以及被认为是公认安全的微生物,已经发展成为备受瞩目的宿主菌。本研究通过对几种有水霉拮抗作用的芽孢杆菌菌株进行比较,确定了一种对水霉生长有明显抑制作用的芽孢杆菌(Bacillus)菌株TCCC11322。在实验确定了菌株培养上清液具有水霉抑制效果后,进一步对TCCC11322发酵上清液中的蛋白质、多糖、多肽等成分进行了分离,对各成分进行抑菌实验研究,结果表明对水霉具有明显抑菌活性的成份是蛋白质组分,而且能达到100μl,10ppm的孔雀石绿的抑制效果,具有进一步开发及应用价值。许多文献报道,多种芽孢杆菌属(Bacillus spp)菌株能向周围环境中分泌蛋白酶类,其中的碱性蛋白酶常常具有杀伤真菌的效果。通过对多种芽孢杆菌属菌株的碱性蛋白酶(apr)基因序列进行比对,发现其序列同源性较高,根据同源序列设计简并引物,扩增得到TCCC11322菌株碱性蛋白酶基因全长序列,包括信号肽(signal peptide)及成熟肽(mature peptide)序列。根据测序得到的TCCC11322菌株碱性蛋白酶基因全长序列设计引物,利用pBSA43质粒构建重组表达载体,转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600,构建了碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌表达菌株,进行分泌表达,并对表达产物进行活性研究。结果表明重组表达菌株分泌表达的碱性蛋白酶具有水霉生长抑制活性。该研究为水霉病生物防治提供了理论借鉴。
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