壳寡糖-乳酸链球菌素美拉德产物抑菌活性及其应用研究

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壳寡糖(Chitooligosaccharide)(CO)是几丁质经脱乙酰基和降解后得到的小分子多糖,具有丰富的来源、良好的溶解性和防腐抗菌活性等特点。然而与传统的化学防腐剂相比,壳寡糖的抗菌活性较低,并且抗菌谱较窄,因此限制了其在食品工业中的广泛应用。乳酸链球菌素(Nisin)是某些乳酸链球菌代谢产生的多肽,具有抑菌性能强、安全性能高等优点。然而乳酸链球菌素存在着抑菌谱较窄、容易受到食品中其他成分干扰等缺点。对天然抑菌剂的针对性改性是提高其使用价值的有效手段。作为一种天然的绿色改性方式,美拉德反应被认为是一种较有前景的改性手段。本文通过湿法加热的方式制备出壳寡糖-乳酸链球菌素美拉德产物(CON-C),并对其结构、抑菌性、理化指标、抑菌机理和毒性进行解析。此外还研究了CON-C在梅鱼保鲜和小鼠肠道菌群调节中的应用。主要研究结果如下:(1)在体系pH值为4.0、反应温度为60℃、壳寡糖/乳酸链球菌素质量比为5:1和壳寡糖分子量为5000 Da的条件下制备出CON-C。CON-C经紫外-可见吸收光谱、红外光谱和核磁共振波谱表征后,确认了壳寡糖与乳酸链球菌素之间发生的美拉德反应。抑菌实验表明,CON-C对金黄色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的半抑制浓度(IC50)值分别为0.016 mg/mL和0.023 mg/mL。显著高于壳寡糖-乳酸链球菌素混合物(CON-M)(金黄色葡萄球菌:IC50=0.038 mg/mL,大肠杆菌:IC50=0.029 mg/mL)。(2)为进一步探索美拉德反应与CON-C抑菌性能之间的关系,研究体系pH值、反应温度、质量比和壳寡糖分子量对CON-C的抑菌性能、反应程度、溶解性和表面带电量的影响。结果表明,当pH从2.0提升至6.0时,壳寡糖与乳酸链球菌素之间的美拉德反应更倾向于产生深褐色的后期产物,在其他条件相同的情况下,pH 6.0下制备的CON-C具有更深颜色的同时,其抑菌性能和溶解性并未能显著提升;温度对最终产物的影响与pH有所不同:当温度从60℃提高至80℃时,CON-C的抑菌性、溶解性和颜色均显著提升;壳寡糖与乳酸链球菌素之间的质量比变化并未能够显著影响CON-C的抑菌性和反应程度的变化规律,这很可能是因为两者之间的整体反应程度较低;当壳寡糖分子量从5000 Da改为1760 Da时,CON-C的抑菌性提高幅度显著减缓。综上所述,最佳的反应条件应为:pH 2.0、反应温度60℃、反应时间24 h、壳寡糖分子量5000 Da和壳寡糖-乳酸链球菌素质量比5:1。(3)选取最佳反应条件下制备的CON-C,研究其抑菌机理,以更全面地了解美拉德反应对于天然抑菌剂的改性作用。由于部分美拉德反应产物被证实具有一定的致突变、致癌和细胞毒性效应,本研究还利用斑马鱼胚胎模型对CON-C的急性毒性进行了检测。结果显示,相比CON-M,CON-C能够更大程度上破坏细菌细胞膜的完整性,增加离子通透性以及增加细菌体内ATP酶的泄露;CON-C对斑马鱼胚胎的致畸率要显著小于焦亚硫酸钠。因此,壳寡糖与乳酸链球菌素经过美拉德反应结合后的产物(CON-C)具有更强抑菌性能,同时还具有较好的安全性。(4)CON-C被应用在梅鱼冷藏保鲜中。对梅鱼冷藏期间的菌落总数(TVC)、挥发性盐基氮(TVB-N)、pH、质构、电子鼻和感官特性的监测发现,CON-C的保鲜性能要优于CON-M。在冷藏6天后,CON-M组梅鱼的TVC、TVB-N和硬度达到了6 log10(CFU/g)、28 mg/100g和15g;而CON-C组梅鱼则为5.1 log10(CFU/g)、21 mg/100g和18g。CON-C更好的保鲜性能很可能与其更强的抑菌性能相关。(5)研究CON-C对高脂肪饮食诱导肥胖小鼠的肠道微生物的调节作用。以高脂肪饮食(HFD)引发的肥胖小鼠作为研究对象,观察添加了CON-C的饲料对其肥胖和肠道菌群的调节作用。结果显示,CON-C能够缓解HFD环境下小鼠的体重增加速度。对小鼠粪便的菌落组成分析发现,CON-C能够显著促进双歧杆菌和乳酸杆菌/肠球菌属的生长,且能显著抑制前叶杆菌和梭菌菌群的生长。利用KEGG和GO对CON-C干预前后的基因表达差异进行了分析,结果表明CON-C可能有助于肠道菌群的稳定,影响相应的代谢途径。
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