论文部分内容阅读
油棕(Elaeis guineensis Jacq.)是世界上产量最高的油料植物之一,因其果实含油量高以及单位面积产油量大而被誉为“世界油王”(雷新涛,曹红星etal.2012)。作为最具特色的热带经济作物之一,其生产的棕榈油主要来源于油棕果实的中果皮,占干重的90%,为目前所报道的含油量最高的植物组织类型。但目前,有关植物油脂积累和代谢的研究中几乎没有涉及到除种子之外的组织材料类型。三酰甘油(Triacylglycero,TAG)是大多数油料作物油脂的积累和储存形式,也是支持幼苗发育的重要碳源。在植物的TAG合成过程中,二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerolacyltransferase,DGAT)负责催化二酰甘油(Diacylglycerol,DAG)与脂肪酸酰基反应形成TAG的过程,是TAG合成途径中的最后一步,也是该途径唯一限速酶。为了深入了解油棕油脂积累机制,两种参与TAG合成的关键酶1型和2型二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1、DGAT2)从油棕中克隆出来。其主要研究结果如下:1.在油棕果实发育的第二和第四时期,油棕1型二酰基甘油酰基转移酶(EgDGAT1)在中果皮中高度表达。与此同时在最后两个时期(第四和第五时期),油棕2型二酰基甘油酰基转移酶(EgDGAT2)在中果皮中高度表达,而在油棕果实成熟过程中油脂积累率逐渐升高。2.从油棕果实中果皮组织中提取RNA,通过5’RACE得到EgDGAT2全长序列。PCR扩增得到EgAGDT1和EgDGAT2基因,大小分别为1710bp和999bp。生物信息学分析结果表明,EgDGAT1基因在C-末端有个保守结构域,且属于DGAT家族。EgDGAT2基因含有两个预测的跨膜结构域,它们相邻且位于N-末端附近。此外,它还具有DGAT2的保守结构域和功能结构域。氨基酸序列分析也表明EgDGAT2编码的蛋白属于DGAT2家族。同时系统进化发育树中EgDGAT2与其他物种中的DGAT2尤其是AtDGAT2属于同一分支的结果也从侧面验证了该假设。3.将EgDGAT1与EgDGAT2基因分别与pYES2载体连接构建酵母表达载体,并将其转入缺陷型酵母H1246中以验证EgDGAT1及EgDGAT2基因在酵母中的体内活性及其功能。结果表明,两种基因均能够恢复H1246酵母合成TAG的功能,并偏好合成棕榈油酸(C16:1)和油酸(C18:1)。4.为了进一步探究EgDGAT2在植物中的体内活性,将EgDGAT2基因与pCAMBIA1300s-napin载体连接构建植物表达载体,通过蘸花法转入拟南芥。荧光定量检测筛选出3株表达量程梯度的纯合拟南芥,收集种子后对其油脂含量及脂肪酸组分进行检测。结果表明,EgDGAT2在拟南芥种子中的特异性过表达提高了种子TAG中多不饱和脂肪酸亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)(各6mol%)的含量。相应地,硬脂酸(C18:0)脂肪酸的比例则降低。与此同时,花生酸(C20:0)的含量也有减少。综上所述,EgDGAT1及EgDGAT2基因均属于DGAT家族,且在突变酵母H1246中的异源表达恢复了具有对不饱和脂肪酸棕桐油酸(C16:1)和油酸(C18:1)的底物偏好的TAG生物合成。此外,EgDGAT2在拟南芥种子中的特异性过表达也显示出对多饱和脂肪酸的偏好性。这些结果为理解油棕中果皮中EgDGAT2的体内活性提供了新的见解,这对于不饱和脂肪酸生产的代谢增强是重要的。