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结肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种在世界范围内常见的恶性胃肠道肿瘤。据2018全球癌症统计数据显示,其发病率及死亡率在全部恶性肿瘤中位居第3位和第2位。目前治疗结肠癌的手段主要有手术治疗、化学药物治疗和放射治疗,而临床中长期使用化疗药物治疗,患者会产生毒副作用和多药耐药性。结肠癌的多药耐药(Multi-drug resistance,MDR)不仅对使用过的化疗药物产生耐受性,而且对于其它未曾使用过的,分子结构、结合靶点及作用机制不同的药物也能产生交叉耐药,这也成为结肠癌治疗的难题。因此,探索结肠癌多药耐药的发生机制,筛选安全有效的肿瘤耐药逆转剂是目前肿瘤研究的热点领域。植物源多酚小分子化合物具有来源广泛、成本低、毒性小、稳定性高及可大规模合成等诸多优势,再加上许多多酚本身具有抗肿瘤活性,具有开发成天然肿瘤耐药逆转剂的潜能。另一方面,有研究显示miRNAs处于调控耐药的网络中心位置,它们能够通过调控众多的下游靶基因而影响结肠癌的多药耐药性;而许多植物源多酚类化合物能够调控miRNAs的表达,进而调节耐药靶基因,参与耐药相关信号通路,增加结肠癌对于药物的敏感性。这说明:miRNAs在介导植物多酚逆转肿瘤耐药活性中扮演了关键角色。本课题组前期研究发现:谷子的副产物谷糠,含有丰富的多酚类化合物,并且谷糠内壳结合态多酚(Bound polyphenol of inner shell,BPIS)在体内外均表现出显著的抗结肠癌功效。但BPIS是否具有逆转结肠癌多药耐药的活性,以及其活性组分和耐药逆转机制尚不明确。因此,本研究以谷糠源活性多酚BPIS为研究对象,从植物多酚调控miRNAs的角度阐释BPIS逆转结肠癌多药耐药性的活性组分及分子机制,为其成为结肠癌多药耐药逆转剂提供理论依据。研究内容和结果主要包括以下几个方面:(1)确定BPIS中具有逆转耐药活性的酚酸组分。采用MTT法发现BPIS对多药耐药株HCT-8/Fu具有浓度依耐性抑制作用,而对人正常结肠上皮细胞FHC无明显作用。前期通过超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪检测出BPIS是由12种酚酸组分构成。根据酚酸分子量对BPIS进行分子截留,分为分子量(MW)<200与MW>200两个部分。MTT结果表明BPIS(MW<200)对结肠癌多药耐药株的增殖具有显著的抑制效应;进一步发现BPIS(MW<200)的6种酚酸中只有阿魏酸和对香豆酸能有效抑制HCT-8/Fu细胞增殖。随后,我们模拟阿魏酸和对香豆酸在BPIS中的天然配比(1:1.13)进行逆转耐药活性分析,发现其活性与BPIS(MW<200)无明显差异,且均没有总多酚BPIS效果明显,这说明BPIS(MW>200)中的酚酸组分对阿魏酸和对香豆酸的逆转耐药活性存在协同效应。(2)BPIS对结肠癌多药耐药株HCT-8/Fu的逆转耐药活性。结果显示:HCT-8细胞对三种化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)、奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)及长春新碱(Vincristine,VCR)的敏感性要显著强于HCT-8/Fu。RT-PCR和westernblot结果显示:多药耐药蛋白1(Multi-drug resistance protein 1,MRP1)、P-gp糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和乳腺癌多药耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)在耐药株HCT-8/Fu的表达显著高于敏感株HCT-8。表明:HCT-8/Fu对5-Fu、L-OHP,VCR均有很强的耐受性。采用细胞克隆、细胞核染色,细胞流式凋亡检测等技术手段,发现BPIS通过抑制HCT-8/Fu细胞增殖、诱导细胞凋亡、增加化疗药物在细胞中的积蓄及抑制多药耐药蛋白的表达来逆转HCT-8/Fu细胞的化疗耐受性。(3)miR-149在BPIS逆转结肠癌多药耐药中的关键作用。RT-PCR实验表明,miR-149在HCT-8/Fu细胞中的表达量显著低于敏感株HCT-8;且BPIS能够上调miR-149在HCT-8/Fu中的表达水平。随后采用miRNA mimics和inhibitor转染细胞,构建敲减或过表达miR-149的细胞模型,发现miR-149在细胞内的表达水平与细胞对化疗药物5-Fu、L-OHP,VCR的化疗敏感性呈正相关。因此,证实BPIS是通过增加结肠癌耐药株HCT-8/Fu中miR-149的表达水平,来发挥其逆转肿瘤多药耐药活性的。(4)BPIS通过抑制miR-149启动子区CpG岛甲基化程度,上调miR-149表达水平。利用Methprimer软件对miR-149编码区前后1000 bp序列进行分析,显示在此区域存在一个大小为173 bp的CpG岛。采用甲基化PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)实验,确定结肠癌多药耐药株HCT-8/Fu中miR-149启动子区CpG岛甲基化程度显著高于结肠上皮细胞株FHC和敏感株HCT-8,而BPIS、阿魏酸和对香豆酸干预后均能降低HCT-8/Fu中miR-149启动子区CpG岛甲基化程度。RT-PCR和westernblot实验发现BPIS、阿魏酸和对香豆酸均能抑制调控基因甲基化程度的关键酶DNMT3a,DNMT3b和MECP2的表达,并且BPIS的抑制效果优于其活性组分阿魏酸,对香豆酸。以上结果表明BPIS是通过调控基因甲基化的方式促进miR-149的表达,增加HCT-8/Fu对化疗药物的敏感性。综上,BPIS对结肠癌多药耐药株HCT-8/Fu细胞具有低毒、高效的耐药逆转能力,且从BPIS(MW<200)中发现阿魏酸和对香豆酸为其主要活性组分;BPIS主要通过抑制HCT-8/Fu细胞增殖,激活其凋亡,增加化疗药物在细胞中的积蓄来发挥逆转结肠癌耐药的能力;进一步发现BPIS通过下调甲基化酶表达来抑制miR-149启动子区CpG岛的甲基化程度,从而增加miR-149的表达,提高HCT-8/Fu细胞对5-Fu、L-OHP,VCR的敏感性。因此,本研究为谷糠活性多酚BPIS在结肠癌耐药逆转剂的研发及应用提供了充实的理论数据。