人类呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是引起世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒病原之一，同时也是免疫抑制或缺陷的成人和老年人呼吸道感染的重要病原。鉴于RSV感染危害严重且无特异有效的治疗方法和疫苗，1994年WHO已将RSV疫苗的研制列为全球疫苗计划的优先发展项目之一。 RSV融合蛋白(Fusion protein，F蛋白)是RSV病毒主要的保护性抗原，并且在RSV A、B两型间相对保守，可以诱生抗野生型RSV感染的中和抗体。其中190～289位氨基酸含有2个重要的抗原表位区，能够被大部分F蛋白特异性单克隆抗体所识别，并且这段氨基酸序列形成的构象也满足了中和表位的要求，这些都为真核表达提供了合理依据。 腺病毒载体是可经粘膜免疫的理想载体，目前已广泛应用于人类疾病的基因治疗，重组疫苗及外源基因在哺乳动物细胞中的表达。本研究首先在Vero细胞上培养RSV(A2株)病毒，从病变细胞中提取了病毒RNA。根据Gene Bank中RSV核苷酸序列设计引物，并在上游引物的5’端分别加入Kpn Ⅰ酶切位点和Kozak片段；下游引物的5’端添加Hind Ⅲ酶切位点和终止密码子TAG。采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-Polymerase chain reaction，RT-PCR)技术特异性扩增出F基因片段(559～867位碱基)，TA克隆后经双酶切、PCR等方法筛选重组质粒，序列分析证实插入序列编码框正确后，再经双酶切、连接等分子生物学手段构建含有目的基因的重组穿梭质粒pShuttle-CMV／F。通过电转化法将经PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-CMV／F和对照质粒pShuttle-CMV-lacZ转入含有pAdEasy-1骨架质粒的BJ5183-AD-1感受态细菌，经鉴定同源重组成功的克隆，命名为重组腺病毒质粒pAdEasy／F和pAdEasy／lacZ。接着，将二者分别转化XL-10 Gold超感受态细菌获得高拷贝重组腺病毒质粒。大量提取重组腺病毒质粒，经Pac Ⅰ酶切回收后定量。运用磷酸钙法转染293细胞，48～72小时内将对照组X-Gal原位染色检测转染效率。实验组于37℃继续培养，7～10天后出现细胞病变(CPE)，成功获得了非复制型重组腺病毒rAd／F。收集病变细胞，在透射电镜下观察重组病毒具有典型的二十面体形态，直径约70nm。PCR结果表明