红细胞是医疗急救不可少的重要医疗资源,其长期保存是输学医学的重要课题之一。相比于常规低温、深低温保存方法,冷冻干燥保存技术是一种潜在的、有效的、经济的红细胞长期保存方法。然而,冻干红细胞膜损伤是阻碍红细胞冻干保存发展的瓶颈之一。因此,如何降低或者修复膜损伤,至今仍然是红细胞保存领域一个亟待解决的重要问题。本课题组前期研究发现,在冷冻干燥过程中,残余水对冻干红细胞回收率具有重要影响,残余水中的结构水对红细胞膜的完整性具有重要作用。目的:本文以结构水为切入点,从以下三个方面进行研究:首先,在冷冻干燥过程中,海藻糖是否通过水替代机制维持红细胞膜结构从而降低膜损伤;其次,从膜相变温度入手,寻找冻干红细胞膜复水过程中自修复的最佳温度,并观察红细胞吸收水分时其体积的变化;最后,当红细胞膜破坏后,探讨脂质体对红细胞膜的修复作用以及对红细胞功能的影响。方法:将红细胞与不同浓度海藻糖负载溶液进行孵育,测定加载到红细胞中海藻糖含量、冻干红细胞复水回收率和残余水含量;应用课题组前期优化的冻干保护剂配方以及冻干程序,制备冻干血影细胞组与冻干红细胞组,测定其残余水含量。为了探讨最佳的膜自我修复温度,将冻干红细胞在不同温度下进行复水,分析红细胞回收率;采用差示量热扫描仪检测冻干血影细胞的相变温度以及环境扫描电镜观察复水过程中冻干红细胞体积的变化。最后,在不同阶段(冷冻干燥、复水、洗脱阶段)添加DOPC脂质体,共设计6个组(包括对照组),检测复水洗脱后红细胞回收率以及其ATP水平、SOD活力。结果:1、当胞外负载海藻糖溶液浓度为100、200、400、600、800、1 000 mmol/L时,红细胞海藻糖加载量(mmol/L)分别为:5.2±0.8、7.6±1.1、11.9±1.0、25.1±3.9、42.8±2.5和55.9±4.3,后三组之间差异具有统计学意义(P<0.05);红细胞复水回收率(%)分别为 31.2±2.5、32.4±1.5、34.1±2.1、45.0±2.1、22.4±2.5,浓度为800mmol/L组,有最高回收率,与其它各组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);红细胞中的残余水含量(%)分别为5.7±0.3、5.7±0.4、5.6±0.4、4.7±0.3、3.5±0.2和2.4±0.2,前三组之间差异无统计学意义,但均与后三组的差异具有统计学意义,且后三组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,冻干红细胞组与冻干血影细胞组残余水含量(%)分别为3.3±0.2、3.1±0.2,P>0.05,尚未发现差异具有统计学意义。2、随着温度升高,冻干红细胞复水后回收率升高(42℃处除外),并在37℃有最高回收率(89.8±6.7%,P<0.05),与其它温度下的回收率相比,差异具有统计学意义。三个样品的相转变温度分别为37.6℃、35.4℃、36.4℃,平均相转变温度是36.5 ±1.2℃,三者之间微小的差异很有可能来源于个体差异。在环境扫描电镜中我们观察到,冻干红细胞直径和厚度先增大后降低。在45miin时,细胞厚度和直径分别达到1.53 μm和6.15μm,相比于原体积,分别增加1.54倍和1.04倍。3、在保护剂、复水液、生理盐水均含有脂质体的实验组中,复水洗脱后红细胞回收率最高,可达到50.7±1.1%,与其它组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组复水洗脱后红细胞回收率为29.0± 1.4%相比,其它组红细胞回收率增高,差异有统计学意义(P<0.05),但各组之间尚未发现差异具有统计学意义(P>0.05)。6组间复水洗脱后红细胞的ATP水平、SOD活力,尚未发现差异具有统计学意义。结论:1、随着负载海藻糖溶液浓度的上升,冻干红细胞海藻糖加载量升高;冻干红细胞复水回收率先平稳后上升;残余水含量先保持不变,然后下降;结合冻干红细胞组与冻干血影细胞组残余水含量相同及前期研究结果,初步证明了残余水分布于冻干红细胞膜上:从而初步证实了在冷冻干燥过程中,海藻糖通过水替代机制保护冻干红细胞膜。2、复水温度对红细胞回收率具有重要影响,37℃可能是膜能进行自我修复的最佳温度;降低细胞体积变化程度,能减轻渗透性损伤,提高红细胞回收率。3、相比于在单个阶段添加脂质体,在冻干保护剂、复水液以及洗脱液中均添加脂质体对冻干红细胞膜具有更好的保护作用,但对洗脱后的红细胞功能尚不具有保护效果。